簡(jiǎn)介：
吲哚菁綠（ICG）是一種用于醫(yī)學(xué)診斷的花青染料。它用于確定心輸出量，肝功能和肝血流量，以及用于眼科血管造影。它具有接近800nm的峰值光譜吸收。這些紅外線頻率穿透視網(wǎng)膜層，使ICG血管造影成像比熒光血管造影更深的循環(huán)模式.ICG與血漿蛋白緊密結(jié)合，變得局限于血管系統(tǒng)。 ICG的半衰期為150至180秒，僅通過(guò)肝臟從膽汁液中排出。近期的一項(xiàng)研究表明，ICG在注射后20分鐘內(nèi)靶向動(dòng)脈粥樣硬化，并提供足夠的信號(hào)增強(qiáng)，用于體內(nèi)檢測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化兔中富含脂質(zhì)的，發(fā)炎的，冠狀動(dòng)脈大小的斑塊。離體熒光反射成像顯示，與注射鹽水的動(dòng)脈粥樣硬化兔相比，注射ICG的動(dòng)脈粥樣硬化兔的斑塊靶 - 背景比高。氨基反應(yīng)性ICG衍生物用于與抗體和其他生物分子制備ICG生物綴合物。所有ICG染料都需要溶解在DMSO中用于標(biāo)記用途。
存儲(chǔ)和處理
收到后，ICG染料應(yīng)儲(chǔ)存在<-15℃，并避免光照和潮濕。ICG染料的重構(gòu)DMSO儲(chǔ)備溶液可以在<-15℃下儲(chǔ)存不到兩周。蛋白質(zhì)綴合物應(yīng)在載體蛋白（例如0.1％牛血清白蛋白）存在下以> 0.5mg / mL儲(chǔ)存。當(dāng)在2mM疊氮化鈉存在下保存并且避光時(shí)，綴合物溶液可以在4℃下儲(chǔ)存兩個(gè)月而沒(méi)有顯著變化。對(duì)于更長(zhǎng)時(shí)間的儲(chǔ)存，可以將蛋白質(zhì)綴合物凍干或分成單次使用的等分試樣并在≤-60℃下儲(chǔ)存，并避光。
物理化學(xué)特性
注釋1.吸收波長(zhǎng)處的消光系數(shù); 2. 260 nm處的CF是用于消除染料在260 nm處對(duì)吸光度的貢獻(xiàn)的校正因子（用于寡核苷酸和核酸標(biāo)記）; 3. 280 nm處的CF是用于消除染料對(duì)280 nm處吸光度的貢獻(xiàn)的校正因子（用于肽和蛋白質(zhì)標(biāo)記）; 5.與蛋白質(zhì)偶聯(lián)后熒光強(qiáng)度顯著增加。
染色細(xì)胞分析
注意：該標(biāo)記方案是針對(duì)山羊抗小鼠IgG與ICG的綴合物開發(fā)的。 您可能需要進(jìn)一步優(yōu)化您的特定蛋白質(zhì)。
操作步驟
1.準(zhǔn)備蛋白質(zhì)儲(chǔ)備溶液（溶液A）：
將100μL反應(yīng)緩沖液（如1 M碳酸鈉溶液或1 M磷酸鹽緩沖液，pH~9.0）與900μL目標(biāo)蛋白溶液（如抗體，蛋白質(zhì)濃度> 2 mg / ml，如果可能）混合至100μL 給予1 mL蛋白質(zhì)標(biāo)記原液。
注1：蛋白質(zhì)溶液（溶液A）的pH值應(yīng)為8.5±0.5。 如果蛋白質(zhì)溶液的pH低于8.0，則使用1M碳酸氫鈉溶液或1M pH 9.0磷酸鹽緩沖液將pH調(diào)節(jié)至8.0-9.0的范圍。
注2：蛋白質(zhì)應(yīng)溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中。 如果蛋白質(zhì)溶解在Tris或甘氨酸緩沖液中，則必須用pH7.2-7.4的1X PBS透析，以除去廣泛用于蛋白質(zhì)沉淀的游離胺或銨鹽（例如硫酸銨和乙酸銨）。
注3：用牛血清白蛋白（BSA）或明膠穩(wěn)定的不純抗體或抗體不能很好地標(biāo)記。 疊氮化鈉或硫柳汞的存在也可能干擾綴合反應(yīng)。 可以通過(guò)透析或旋轉(zhuǎn)柱除去疊氮化鈉或硫柳汞，以獲得標(biāo)記結(jié)果。
注4：如果蛋白質(zhì)濃度低于2 mg / mL，則結(jié)合效率會(huì)顯著降低。 為獲得標(biāo)記效率，建議蛋白質(zhì)濃度范圍為2-10 mg / mL。
2.準(zhǔn)備染料儲(chǔ)備溶液（溶液B）：
將無(wú)水DMSO加入到ICG染料小瓶中以制備10-20mM儲(chǔ)備溶液。 通過(guò)移液或渦旋混合均勻。
注意：在開始綴合前準(zhǔn)備染料儲(chǔ)備溶液（溶液B）。 及時(shí)使用。 染料儲(chǔ)備溶液的長(zhǎng)期儲(chǔ)存可降低染料活性。 溶液B可在冰箱中保存兩周，避光保存。 避免凍融循環(huán)。
3.確定染料/蛋白質(zhì)比例（可選）：
注意：每種蛋白質(zhì)都需要不同的染料/蛋白質(zhì)比例，這也取決于染料的性質(zhì)。蛋白質(zhì)的過(guò)度標(biāo)記可能不利地影響其結(jié)合親和力，而低染料/蛋白質(zhì)比率的蛋白質(zhì)綴合物會(huì)降低靈敏度。我們建議您通過(guò)使用連續(xù)不同量的標(biāo)記染料溶液重復(fù)步驟4和5來(lái)實(shí)驗(yàn)確定染料/蛋白質(zhì)比率。通常，對(duì)于大多數(shù)染料 - 蛋白質(zhì)綴合物，推薦使用4-6種染料/蛋白質(zhì)。
3.1使用10：1摩爾比的溶液B（染料）/溶液A（蛋白質(zhì)）作為起始點(diǎn)：將5μl染料儲(chǔ)備溶液（溶液B，假設(shè)染料儲(chǔ)備溶液為10 mM）加入到樣品瓶中。蛋白質(zhì)溶液（95μl溶液A）有效搖動(dòng)。假設(shè)蛋白質(zhì)濃度為10mg / mL并且蛋白質(zhì)的分子量為~200KD，蛋白質(zhì)的濃度為~0.05mM。
注意：蛋白質(zhì)溶液中DMSO的濃度應(yīng)<10％。
3.2運(yùn)行綴合反應(yīng)（參見下面的步驟4）。
3.3重復(fù)＃3.2，溶液B /溶液A的摩爾比為5：1;分別為15：1和20：1。
3.4使用預(yù)制的旋轉(zhuǎn)柱純化所需的綴合物。
3.5計(jì)算上述4種結(jié)合物的染料/蛋白質(zhì)比（DOS）（見下頁(yè)）。
3.6運(yùn)行上述4種結(jié)合物的功能測(cè)試，確定染料/蛋白質(zhì)比例，以擴(kuò)大標(biāo)記反應(yīng)。
4.運(yùn)行結(jié)合反應(yīng)：
4.1在有效搖動(dòng)下，將適量的染料儲(chǔ)備溶液（溶液B）加入到蛋白質(zhì)溶液（溶液A）的小瓶中。
注意：溶液B /溶液的摩爾比由步驟3.6確定。 如果跳過(guò)步驟3，我們建議使用10：1摩爾比的溶液B（染料）/溶液A（蛋白質(zhì)）。
4.2繼續(xù)在室溫下旋轉(zhuǎn)或搖動(dòng)反應(yīng)混合物30-60分鐘。
5.純化綴合物
以下方案是使用Sephadex G-25柱純化染料 - 蛋白質(zhì)綴合物的實(shí)例。
5.1按照制造說(shuō)明準(zhǔn)備Sephadex G-25色譜柱。
5.2將反應(yīng)混合物（直接從步驟4）加載到Sephadex G-25柱的頂部。
5.3樣品在頂部樹脂表面下方運(yùn)行時(shí)立即加入PBS（pH 7.2-7.4）。
5.4向所需樣品中加入更多PBS（pH 7.2-7.4）以完成色譜柱純化。 合并含有所需染料 - 蛋白質(zhì)綴合物的級(jí)分。
注1：立即使用時(shí)，染料 - 蛋白質(zhì)偶聯(lián)物需要用染色緩沖液稀釋，并等分多次使用。
注2：對(duì)于長(zhǎng)期儲(chǔ)存，染料 - 蛋白質(zhì)綴合物溶液需要濃縮或冷凍干燥（見下文）。
表征所需的染料 - 蛋白質(zhì)綴合物
取代度（DOS）是表征染料標(biāo)記蛋白質(zhì)的重要因素。 較低DOS的蛋白質(zhì)通常具有較弱的熒光強(qiáng)度，但較高DOS（例如DOS> 6）的蛋白質(zhì)也傾向于具有減少的熒光。 根據(jù)染料和蛋白質(zhì)的特性，大多數(shù)抗體的DOS建議在2到10之間。 為了有效標(biāo)記，應(yīng)將取代度控制為對(duì)于1摩爾抗體具有4-10摩爾的ICG。 以下步驟用于確定ICG標(biāo)記蛋白的DOS。
2.讀取280nm處的OD（吸光度）和染料吸收（ICG染料的?max= 785nm）：
對(duì)于大多數(shù)分光光度計(jì)，樣品（來(lái)自柱級(jí)分）需要用去離子水稀釋，使得OD值在0.1至0.9的范圍內(nèi)。 280nm處的O.D.（吸光度）是蛋白質(zhì)的極大吸收，而785nm是ICG染料的極大吸收。 為了獲得準(zhǔn)確的DOS，確保綴合物不含非共軛染料。
3. 使用以下等式計(jì)算DOS：
[Dye]是染料濃度，并且可以根據(jù)Bee-Lambert定律容易地計(jì)算：A =εdyeCL。 [protein]是蛋白質(zhì)濃度。 如果共軛效率足夠高（優(yōu)選> 70％）或通過(guò)比爾 - 朗伯定律更準(zhǔn)確地計(jì)算，則該值可以通過(guò)重量（加入反應(yīng)）估算：A =ε蛋白質(zhì)CL。 例如，IgG的ε值為203,000cm-1M-1.Pε280= 280nm處的蛋白質(zhì)摩爾消光系數(shù)（例如IgG的摩爾消光系數(shù)為203,000cm-1M-1）。 對(duì)于ICG-Sulfo-OSu，CF（280nm處的染料吸收校正因子）= OD280 / OD750 = 0.073。 230,000cm-1M-1是ICG-Sulfo-OSu的摩爾消光系數(shù)。
參考文獻(xiàn)
1. Hermanson GT (1996). Biocojugate Techniques, Academic Press, New York. 2. Haugland RP (1995). Coupling of monoclonal antibodies with fluorophores. Methods Mol Biol 45, 205-21.
3. Brinkley M (1992). A brief survey of methods for preparing protein conjugates with dyes, haptens, and cross-linking reagents. Bioconjug Chem 3, 2-13.