簡介
iFluor 染料是一系列優(yōu)良的熒光標記染料，可以覆蓋整個可見光譜。所有iFluor 染料都具有優(yōu)異的水溶性。它們的親水性使有機溶劑的使用極小化。 iFluor 染料也具有比經(jīng)典熒光標記染料更好的標記性能，如FITC，TRITC，Texas Red ，Cy3 ，Cy5和Cy7 。一些iFluor 染料在某些抗體上明顯優(yōu)于Alexa Fluor 標記染料。它們是用于標記蛋白質和核酸而不包含性能的極便宜的熒光染料（替代Alexa Fluor 染料）。每種iFluor染料的開發(fā)都與特定的Alexa Fluor 或其他標記染料（如DyLight 染料）的光譜特性相匹配。
琥珀酰亞胺基（NHS）酯被證明是用于胺修飾的**試劑，因為形成的酰胺鍵基本上與天然肽鍵相同并且穩(wěn)定。這些試劑通常是穩(wěn)定的并且與脂族胺顯示出良好的反應性和選擇性。當琥珀酰亞胺酯化合物用于綴合反應時，需要考慮的因素很少：1）。溶劑：在大多數(shù)情況下，活性染料應溶于無水二甲基甲酰胺（DMF）或二甲基亞砜（DMSO）中。 2）。反應pH：胺與琥珀酰亞胺酯的標記反應強烈依賴于pH。胺反應性試劑與非質子化脂族胺基團反應，包括蛋白質的末端胺和賴氨酸的β-氨基。因此，胺?；磻ǔＴ?/span>pH 7.5以上進行。通過琥珀酰亞胺酯進行的蛋白質修飾通?？梢栽?/span>pH 8.5-9.5下進行。 3）。反應緩沖液：使用胺反應試劑時，必須避免使用含有游離胺（如Tris和甘氨酸）和硫醇化合物的緩沖液。廣泛用于蛋白質沉淀的銨鹽（例如硫酸銨和乙酸銨）也必須在進行染料綴合之前除去（例如通過透析）。 4）。反應溫度：大多數(shù)綴合在室溫下進行。然而，特定標記反應可能需要升高或降低的溫度。
存儲和處理
收到后，iFluor?染料應儲存在<-15 oC，并避免光照和潮濕。 iFluor?染料的重構DMSO儲備溶液可以在<-15℃下儲存不到兩周。 蛋白質綴合物應在載體蛋白（例如0.1％牛血清白蛋白）存在下以> 0.5mg / mL儲存。 當在2mM疊氮化鈉存在下保存并且避光時，綴合物溶液可以在4℃下儲存兩個月而沒有顯著變化。 對于更長時間的儲存，可以將蛋白質綴合物凍干或分成單次使用的等分試樣并在≤-60℃下儲存，并避光。
染色樣本分析
注意：該標記方案是針對山羊抗小鼠IgG與iFluor?647 SE的綴合物開發(fā)的。 您可能需要進一步優(yōu)化您的特定蛋白質。
操作步驟
1.準備蛋白質儲備溶液（溶液A）：
將100μL反應緩沖液（如1 M碳酸鈉溶液或1 M磷酸鹽緩沖液，pH~9.0）與900μL目標蛋白溶液（如抗體，蛋白質濃度> 2 mg / ml，如果可能）混合至100μL給予1 mL蛋白質標記原液。
注1：蛋白質溶液（溶液A）的pH值應為8.5±0.5。如果蛋白質溶液的pH低于8.0，則使用1M碳酸氫鈉溶液或1M pH 9.0磷酸鹽緩沖液將pH調節(jié)至8.0-9.0的范圍。
注2：蛋白質應溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中。如果蛋白質溶解在Tris或甘氨酸緩沖液中，則必須用pH7.2-7.4的1X PBS透析，以除去廣泛用于蛋白質沉淀的游離胺或銨鹽（例如硫酸銨和乙酸銨）。
注3：用牛血清白蛋白（BSA）或明膠穩(wěn)定的不純抗體或抗體不能很好地標記。疊氮化鈉或硫柳汞的存在也可能干擾綴合反應?？梢酝ㄟ^透析或旋轉柱除去疊氮化鈉或硫柳汞，以獲得**標記結果。
注4：如果蛋白質濃度低于2 mg / mL，則結合效率會顯著降低。為獲得**標記效率，建議極終蛋白質濃度范圍為2-10 mg / mL。
2.準備染料儲備溶液（溶液B）：
將無水DMSO加入到iFluor TM染料SE小瓶中以制備10-20mM儲備溶液。 通過移液或渦旋混合均勻。
注意：在開始綴合前準備染料儲備溶液（溶液B）。 及時使用。 染料儲備溶液的長期儲存可降低染料活性。 溶液B可在冰箱中保存兩周，避光保存。 避免凍融循環(huán)。
3.確定**染料/蛋白質比例（可選）：
注意：每種蛋白質都需要不同的染料/蛋白質比例，這也取決于染料的性質。蛋白質的過度標記可能不利地影響其結合親和力，而低染料/蛋白質比率的蛋白質綴合物會降低靈敏度。我們建議您通過使用連續(xù)不同量的標記染料溶液重復步驟4和5來實驗確定**染料/蛋白質比率。通常，對于大多數(shù)染料 - 蛋白質綴合物，推薦使用4-6種染料/蛋白質。
3.1使用10：1摩爾比的溶液B（染料）/溶液A（蛋白質）作為起始點：將5μl染料儲備溶液（溶液B，假設染料儲備溶液為10 mM）加入到樣品瓶中。蛋白質溶液（95μl溶液A）有效搖動。假設蛋白質濃度為10mg / mL并且蛋白質的分子量為~200KD，蛋白質的濃度為~0.05mM。
注意：蛋白質溶液中DMSO的濃度應<10％。
3.2運行綴合反應（參見下面的步驟4）。
3.3重復＃3.2，溶液B /溶液A的摩爾比為5：1;分別為15：1和20：1。
3.4使用預制的旋轉柱純化所需的綴合物。
3.5計算上述4種結合物的染料/蛋白質比（DOS）（見下頁）。
3.6運行上述4種結合物的功能測試，確定**的染料/蛋白質比例，以擴大標記反應。
4.運行結合反應：
4.1有效加入適量的染料儲備溶液（溶液B）到蛋白質溶液（溶液A）的小瓶中晃動。
注意：溶液B /溶液的**摩爾比由步驟3.6確定。如果跳過步驟3，我們建議使用10：1溶液B（染料）/溶液A（蛋白質）的摩爾比。
4.2繼續(xù)在室溫下旋轉或搖動反應混合物30-60分鐘。
5.純化綴合物
以下方案是使用Sephadex G-25柱純化染料 - 蛋白質綴合物的實例。
5.1按照制造說明準備Sephadex G-25色譜柱。
5.2將反應混合物（直接從步驟4）加載到Sephadex G-25柱的頂部。
5.3樣品在頂部樹脂表面下方運行時立即加入PBS（pH 7.2-7.4）。
5.4向所需樣品中加入更多PBS（pH 7.2-7.4）以完成色譜柱純化。 合并含有所需染料 - 蛋白質綴合物的級分。
注1：立即使用時，染料 - 蛋白質偶聯(lián)物需要用染色緩沖液稀釋，并等分多次使用。
注2：對于長期儲存，染料 - 蛋白質綴合物溶液需要濃縮或冷凍干燥（見下文）。
表征所需的染料 - 蛋白質綴合物
取代度（DOS）是表征染料標記蛋白質的極重要因素。 較低DOS的蛋白質通常具有較弱的熒光強度，但較高DOS（例如DOS> 6）的蛋白質也傾向于具有減少的熒光。 根據(jù)染料和蛋白質的特性，大多數(shù)抗體的**DOS建議在2到10之間。 為了有效標記，應將取代度控制為對于1摩爾抗體具有4-10摩爾的iFluor TM 647 SE。 以下步驟用于確定iFluor TM 647 SE標記蛋白的DOS。
1.測量吸收：
為了測量染料 - 蛋白質綴合物的吸收光譜，建議根據(jù)染料的消光系數(shù)將樣品濃度保持在1-10μM的范圍內。
2. 讀取280 nm處的OD（吸光度）和染料極大吸收（iFluor?647染料的?max= 649 nm）：對于大多數(shù)分光光度計，樣品（來自色譜柱部分）需要用去離子水稀釋，以便OD 值在0.1至0.9的范圍內。 O.D. （280nm處的吸光度）是蛋白質的極大吸收，而649nm是iFluor TM 647 SE的極大吸收。 為了獲得準確的DOS，確保綴合物不含非共軛染料。
3. 使用以下等式計算DOS：
[染料]是染料濃度，并且可以根據(jù)Bee-Lambert定律容易地計算：A =εdyeCL。 [蛋白質]是蛋白質濃度。 如果共軛效率足夠高（優(yōu)選> 70％）或通過比爾 - 朗伯定律更準確地計算，則該值可以通過重量（加入反應）估算：A =ε蛋白質CL。 例如，IgG的ε值為203,000cm-1M-1。 Pε280= 280nm處的蛋白質摩爾消光系數(shù)（例如IgG的摩爾消光系數(shù)為203,000cm-1M-1）。 對于iFluor TM 647染料SE，CF（280nm處的染料吸收校正因子）= OD280 / OD649 = 0.03。 250,000 cm-1M-1是iFluor?647 SE的摩爾消光系數(shù)。
參考文獻
1. Hermanson GT (1996). Biocojugate Techniques, Academic Press, New York.
2. Haugland RP (1995). Coupling of monoclonal antibodies with fluorophores. Methods Mol Biol 45, 205-21.
3. Brinkley M (1992). A brief survey of methods for preparing protein conjugates with dyes, haptens, and cross-linking reagents. Bioconjug Chem 3, 2-13.