基本信息
貨號：13601
儲存條件：保存在冰箱中，避光
適用儀器：熒光顯微鏡
簡介
組蛋白去乙酰化酶（HDAC）是一類從組蛋白上的ε-N-乙?；嚢彼岚被嶂谐ヒ阴；拿?。去乙?；謴?fù)賴氨酸氨基酸的正電荷，這增加了組蛋白對DNA的帶負(fù)電荷的磷酸骨架的親和力。該過程通常通過阻斷轉(zhuǎn)錄因子的進入來下調(diào)DNA轉(zhuǎn)錄。正在研究HDAC抑制劑作為癌癥的**方法。
我們的Amplite?熒光HDAC活性檢測試劑盒為檢測HDAC活性提供了一種快速，方便，靈敏的方法。該試劑盒使用我們的非肽HDAC Green?底物，它比基于肽的HDAC底物（如Ac-RGK（Ac）-R110，Ac-RGK（Ac）-AMC和Ac-RGK（Ac） - 更敏感 - AFC。此外，HDAC Green?底物比其他商業(yè)肽基HDAC底物更耐蛋白酶水解。我們的試劑盒可用于測量細(xì)胞裂解液中的HDAC活性或用細(xì)胞提取物或純化酶篩選HDAC抑制劑。 HDAC Green?底物的長波長發(fā)射使得該測定不受化合物和細(xì)胞組分的干擾。用490nm的激發(fā)和525nm的發(fā)射監(jiān)測HDAC活性。
試劑盒主要特點
廣泛應(yīng)用：可用于量化溶液和細(xì)胞提取物中的HDAC。
連續(xù)性：無需分離步驟即可輕松適應(yīng)自動化。
方便：配方具有*小的手動操作時間。 不需要洗滌。
非放射性：對廢物處理沒有特殊要求。
試劑盒組成
96孔板樣品測定方案
簡要概括
準(zhǔn)備含有HDAC的樣品（40μL）®
添加HDAC抑制劑或測試化合物（10μL）®
在室溫或37 oC孵育10-20分鐘®添加HDAC Green?底物工作溶液（50μL）®
在室溫下孵育或 37 oC持續(xù)30-60分鐘®
在Ex / Em = 490/525 nm處監(jiān)測熒光強度
操作步驟
1.準(zhǔn)備工作解決方案：
1.1制備含有HDAC的測試樣品：在測定緩沖液（組分B）中以1:40稀釋5-10mg / mL HeLa核提取物或細(xì)胞裂解物。
注意：40μL稀釋樣品足以用于96孔板的一個孔。使用前立即稀釋提取物。將溶液儲存在冰上。
1.2制備HDAC抑制劑（Trichostain A）溶液的稀釋液：在測定緩沖液（組分B）中以1：100稀釋3mM曲古抑菌素A溶液（組分C），得到30μM曲古抑菌素A溶液。向每個抑制劑對照孔中加入10μL30μM曲古抑菌素A溶液。
1.3準(zhǔn)備HDAC Green?底物工作溶液：將20μLHDACGreen?底物（組分A）和100μL信號增強劑（組分D）加入5 mL分析緩沖液（組分B）中。
注意1：稀釋的HDAC Green?底物工作溶液不穩(wěn)定，5 mL稀釋的HDAC Green?底物工作溶液足以進行100次分析。
注2：為每個實驗準(zhǔn)備新鮮的HDAC Green?底物工作溶液。將重構(gòu)的工作溶液保持在冰上直至使用。
2.運行HDAC分析：
2.1將40μL稀釋的核提取物，酶溶液或其他HDAC樣品和10μL測試化合物加入相應(yīng)的微孔板孔中（見表1）。
對于陽性對照：加入40μL稀釋的HDAC酶溶液或HeLa核提取物（來自步驟1.1）和10μL分析緩沖液（組分B）。對于陰性對照：加入40μL稀釋的HeLa核提取物（來自步驟1.1），加入10μL μL的30μM曲古抑菌素A溶液（來自步驟1.2），或使用不含HDAC活性的已知樣品。對于空白（無酶）：僅添加50μL的測定緩沖液（組分B）。
2.2在室溫或37℃孵育平板10-20分鐘。
注意：為了篩選HDAC抑制劑，在添加HDAC Green?底物工作溶液之前，先用HeLa核提取物或純酶預(yù)孵育這些化合物（參見步驟2.3）
2.3將50μLHDACGreen?底物工作溶液（來自步驟1.3）加入每個孔中。將板在室溫或37℃孵育30-60分鐘。
2.4在Ex / Em = 490/525 nm處監(jiān)測熒光強度。
表1.在96孔微孔板中的測試化合物的核提取物的布局
數(shù)據(jù)分析
空白孔中的熒光（僅使用測定緩沖液）用作背景熒光，并且用具有HDAC Green TM反應(yīng)的那些孔的值減去。 所有熒光讀數(shù)均以相對熒光單位（RFU）表示。 典型數(shù)據(jù)如圖1所示。
圖1.曲古抑菌素A使用Gemini熒光酶標(biāo)儀（Molecular Devices），用Amplite TM熒光HDAC活性測定試劑盒測量HeLa核提取物中的抑制。
圖2.使用Amplite?熒光測定法測定HeLa核提取物中的HDAC活性HDAC活性測定試劑盒（藍色）與供應(yīng)商X（紅色）和供應(yīng)商Y（綠色）進行比較，兩者均使用Ac-RGK（Ac） -R110肽底物。 使用Amplite?熒光HDAC活性測定試劑盒測量的HDAC活性的信號/背景比率比供應(yīng)商X和Y高10倍以上。
參考文獻
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