基本信息
貨號(hào)：15271
儲(chǔ)存條件：保存在冰箱，避光
適用儀器：吸光板酶標(biāo)儀
簡(jiǎn)介
煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP +）是在細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的兩種重要的輔因子。 NADH是NAD +的還原形式。 NAD形成NADP，通過酯鍵將磷酸基團(tuán)添加到腺苷核苷酸的2'位置。 傳統(tǒng)的NAD / NADH和NADP / NADPH測(cè)定基于監(jiān)測(cè)340nm處NADH或NADPH吸收的變化。 NAD / NADH和NADP / NADPH測(cè)定的短紫外波長(zhǎng)使得傳統(tǒng)方法具有低靈敏度和高干擾。 AAT Bioquest的Amplite?比色NADH檢測(cè)試劑盒為檢測(cè)NADH提供了一種便捷的方法。 NADH探針是一種生色傳感器，在NADH減少時(shí)具有460nm的極大吸光度。 NADH探針的吸收與溶液中NADH的濃度成正比。 Amplite?比色NADH分析試劑盒提供靈敏的分析，可在100μL分析體積中檢測(cè)低至3μM的NADH。
試劑盒組成
96孔板的檢測(cè)分析
簡(jiǎn)要概括
準(zhǔn)備NADH反應(yīng)混合物（50μL）®
添加NADH標(biāo)準(zhǔn)品或測(cè)試樣品（50μL）®
在室溫下孵育15分鐘至2小時(shí)®
監(jiān)測(cè)460 nm處的吸光度
注意：在開始實(shí)驗(yàn)之前，在室溫下解凍每個(gè)試劑盒組分中的一個(gè)
操作步驟
1.準(zhǔn)備NADH儲(chǔ)備溶液：
將200μLPBS緩沖液加入到NADH標(biāo)準(zhǔn)品（組分C）的小瓶中以制備1mM（1nmol /μL）NADH儲(chǔ)備溶液。
注意：未使用的NADH儲(chǔ)備溶液應(yīng)分成單次使用的等分試樣并儲(chǔ)存在-20℃。
2.準(zhǔn)備NADH反應(yīng)混合物：
將1mL NADH探針（組分A）加入4mL NADH測(cè)定緩沖液（組分B）中，并充分混合。
注意：5mL NADH反應(yīng)混合物用于一個(gè)96孔。未使用的NADH反應(yīng)混合物應(yīng)分成單次使用的等分試樣并儲(chǔ)存在-20℃。
3.準(zhǔn)備NADH標(biāo)準(zhǔn)品的連續(xù)稀釋液（0至100μM）：
3.1將100μL的NADH儲(chǔ)備液（來自步驟1）加入400μLPBS緩沖液（pH 7.4）中，生成200μM（100 pmol / L）NADH標(biāo)準(zhǔn)溶液。注意：稀釋的NADH標(biāo)準(zhǔn)溶液不穩(wěn)定，應(yīng)在4小時(shí)內(nèi)使用。
3.2取200μL的200μMNADH標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行1：2連續(xù)稀釋，得到NADH標(biāo)準(zhǔn)品的100,50,25,12.5,6.25,3.13和0μM連續(xù)稀釋液。
3.3如表1和2所述，將NADH標(biāo)準(zhǔn)品和含有NADH的測(cè)試樣品的系列稀釋液加入白色/透明底96孔微量培養(yǎng)板中。注意：根據(jù)需要制備細(xì)胞或組織樣品。
表1白色/透明底96孔微孔板中NADH標(biāo)準(zhǔn)品和測(cè)試樣品的布局
表2每個(gè)孔的試劑組成
*注意：將連續(xù)稀釋的NADH標(biāo)準(zhǔn)品（3.13μM至200μM）加入NS1至NS7的孔中，一式兩份。
4.在上清液反應(yīng)中運(yùn)行NADH測(cè)定：
4.1將50μL的NADH反應(yīng)混合物（來自步驟2）加入NADH標(biāo)準(zhǔn)品，空白對(duì)照和測(cè)試樣品的每個(gè)孔中（參見步驟3.3），使總NADH測(cè)定體積為100μL/孔
注1：對(duì)于384孔板，每孔加入25μL樣品和25μLNADH反應(yīng)混合物。
注2：根據(jù)需要準(zhǔn)備細(xì)胞或組織樣本。 為方便起見，裂解緩沖液（組分D）可用于裂解細(xì)胞（詳見附錄）。
4.2在室溫下孵育反應(yīng)15分鐘至2小時(shí)，避光。
4.3使用吸光度讀板儀在460 nm處監(jiān)測(cè)吸光度的增加。
數(shù)據(jù)分析
空白孔中的吸光度（僅使用PBS緩沖液）用作對(duì)照，并從具有NADH反應(yīng)的那些孔的值中減去。 NADH標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。
圖1。 使用SpectraMax酶標(biāo)儀（Molecular devices），使用Amplite?比色NADH分析試劑盒在96孔白色/透明底板中測(cè)量NADH劑量反應(yīng)。孵育30分鐘可檢測(cè)到低至3μM的NADH（n = 3） 在460nm處測(cè)量吸光度。
附錄：使用組分D（裂解緩沖液）的測(cè)試樣品制劑
1.植物細(xì)胞樣品：用200mg / mL的裂解緩沖液均質(zhì)化，并以2500rpm離心5-10分鐘，使用上清液進(jìn)行測(cè)試。
2.**細(xì)胞樣品：離心收集**細(xì)胞（（10,000 g，0°C，15 min）。使用約1億至1千萬(wàn)細(xì)胞/ mL裂解緩沖液，將處理后的溶液在室溫下保持15分鐘.2500℃離心 轉(zhuǎn)速5分鐘，用上清液進(jìn)行試驗(yàn)。
3.哺乳動(dòng)物細(xì)胞樣品：從平板孔中取出培養(yǎng)基，每1-5百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞使用約100μL裂解緩沖液（或在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中使用50-100μL/孔），并將處理過的溶液保持在室溫下 15分鐘。 直接使用細(xì)胞裂解液或以1500 rpm離心5分鐘，使用上清液進(jìn)行測(cè)試。
4.組織樣品：稱取約20mg組織，用冷PBS洗滌。 在微量離心管中用400μl裂解緩沖液均化。以2500rpm離心5-10分鐘，使用上清液進(jìn)行測(cè)定。
參考文獻(xiàn)
1. Eugenia Villa-Cuesta, Marissa A. Holmbeckand David M. Rand. Rapamycin increases mitochondrial efficiency by mtDNA-dependent reprogramming of mitochondrial metabolism in Drosophila. Journal of Cell Science (2014) 127, 2282–2290 doi:10.1242/jcs.142026.
2. Chao Tong, Alex Morrison, Samantha Mattison, Su Qian, Mark Bryniarski, Bethany Rankin, Jun Wang, D. Paul Thomas, and Ji Li. Impaired SIRT1 nucleocytoplasmic shuttling in the senescent heart during ischemic stress. FASEB J, Nov 2013; 27: 4332 - 4342.
3. Rubin Tan, Jiansha Li, Xiaochun Peng, Liping Zhu, Lei Cai, Tao Wang, Yuan Su, Kaikobad Irani, and Qinghua Hu. GAPDH is critical for superior efficacy of female bone marrow-derived mesenchymal stem cells on pulmonary hypertension. Cardiovasc Res, Oct 2013; 100: 19 - 27.
4. Stephen Y. Xue, Valeria Y. Hebert, Danicia M. Hayes, Corie N. Robinson, Mitzi Glover, and Tammy R. Dugas. Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors Induce a Mitophagy-Associated Endothelial Cytotoxicity That Is Reversed by Coenzyme Q10 Cotreatment. Toxicol. Sci., Aug 2013; 134: 323 - 334.
5. Kate J. Roberts, Andrew Cross, Olga Vasieva, Robert J. Moots, and Steven W. Edwards. Inhibition of pre-B cell colony-enhancing factor (PBEF/NAMPT/visfatin) decreases the ability of human neutrophils to generate reactive oxidants but does not impair bacterial killing. J. Leukoc. Biol., Sep 2013; 94: 481 - 492.
6. Weijing Cai, Maya Ramdas, Li Zhu, Xue Chen, Gary E. Striker, and Helen Vlassara. Oral advanced glycation endproducts (AGEs) promote insulin resistance and diabetes by depleting the antioxidant defenses AGE receptor-1 and sirtuin 1. PNAS, Sep 2012; 109: 15888 - 15893.
7. Yue Qiu, Claus Tittiger, Claude Wicker-Thomas, Ga?lle Le Goff, Sharon Young, Eric Wajnberg, Thierry Fricaux, Nathalie Taquet, Gary J. Blomquist, and René Feyereisen. An insect-specific P450 oxidative decarbonylase for cuticular hydrocarbon biosynthesis. PNAS, Sep 2012; 109: 14858 - 14863. 8. Jaime Uribarri, Weijing Cai, Maya Ramdas, Susan Goodman, Renata Pyzik, Xue Chen, Li Zhu, Gary E. Striker, and Helen Vlassara. Restriction of Advanced Glycation End Products Improves Insulin Resistance in Human Type 2 Diabetes: Potential role of AGER1 and SIRT1. Diabetes Care 2011; 34: 1610 - 1616.