簡(jiǎn)介
鈣通量測(cè)定是用于篩選G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）的**發(fā)現(xiàn)中的優(yōu)選方法。 我們的Fluo-8®和Rhod-4?系列鈣檢測(cè)試劑是極亮的綠色和紅色鈣指示劑，而我們的Cal-520®和Cal-590?具有極高的細(xì)胞內(nèi)鈣檢測(cè)信號(hào)/背景比，因?yàn)樗鼈冊(cè)?活細(xì)胞。 AAT Bioquest提供其他鈣指標(biāo)，如Fluo-4，Fluo-3，Fura-2，Indo-1，Rhod-5N和Rhod-2 AM，質(zhì)量極高。
表1.鈣檢測(cè)試劑的光譜和Ca2 +結(jié)合特性
* Cal Green?1與Calcium Green-1的分子相同
表2.葡聚糖，生物素或生物胞素綴合的熒光鈣指示劑
儲(chǔ)存條件
儲(chǔ)存于-20°C，避光。 到期日為自收到之日起12個(gè)月。
使用鈣指示劑AM酯類(lèi)
1.使用鈣指示劑AM Esters加載細(xì)胞：
AM酯是非極性酯，其易于穿過(guò)活細(xì)胞膜，并且通過(guò)活細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞酯酶快速水解。 AM酯廣泛用于非侵入性地將各種極性熒光探針裝載到活細(xì)胞中。 但是，使用AM酯時(shí)必須小心謹(jǐn)慎，因?yàn)樗鼈円子谑褂盟?，特別是在溶液中。 它們應(yīng)該用高質(zhì)量的無(wú)水二甲基亞砜（DMSO）重新配制。 DMSO儲(chǔ)備溶液應(yīng)在-20°C下干燥保存并避光。 在這些條件下，AM酯應(yīng)穩(wěn)定數(shù)月。
以下是我們推薦的將AM酯加載到活細(xì)胞中的方案。 該協(xié)議僅提供指南，應(yīng)根據(jù)您的特定需求進(jìn)行修改。
a）在高質(zhì)量無(wú)水DMSO中制備2至5mM AM酯原液。
b）在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將鈣指示劑溶解在DMSO中固體或?qū)⒌确莸闹甘緞﹥?chǔ)備溶液解凍至室溫。 使用0.04％Pluronic®F-127在您選擇的緩沖液（如Hanks和Hepes緩沖液）中制備2至20μM的工作溶液。 對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞系，我們建議鈣指示劑的濃度為4-5μM。 指標(biāo)的確切濃度細(xì)胞加載所需的必須根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。 為避免因過(guò)載和潛在染料毒性引起的任何偽影，建議使用能夠產(chǎn)生足夠信號(hào)強(qiáng)度的極小探針濃度。
注意：非離子型洗滌劑Pluronic®F-127有時(shí)用于增加鈣指示劑AM酯的水溶性。 各種Pluronic®F-127解決方案可從AAT Bioquest購(gòu)買(mǎi)。
c）如果您的細(xì)胞（如CHO細(xì)胞）含有有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，丙磺舒（2-5 mM）或磺吡酮（0.2-0.5 mM）可能會(huì)添加到染料工作溶液中（濃度為1） 對(duì)丙磺舒為-2.5 mM，對(duì)于磺胺吡喃酮為0.1-0.25 mM）以減少去酯化指示劑的泄漏。
注意：各種ReadiUse?丙磺舒（包括水溶性鈉鹽和穩(wěn)定溶液）均可從AAT Bioquest購(gòu)買(mǎi)
d）將等體積的染料工作溶液（來(lái)自步驟b或c）加入細(xì)胞板中。
e）將染料加載板室在溫度或37℃下孵育20分鐘（尤其是Fluo-8AM）至2小時(shí)，然后將板在室溫下再孵育30分鐘。
注1：降低加載溫度可能會(huì)減少指示符的劃分。
注2：孵育Cal-520 AM超過(guò)2小時(shí)可以為某些細(xì)胞系提供更好的信號(hào)強(qiáng)度
f）用HHBS或您選擇的緩沖液（含有陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑，如1mM丙磺舒，如果適用）替換染料工作溶液，以去除多余的探針。
g）在所需的Ex / Em波長(zhǎng)下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（見(jiàn)表1）。
2.測(cè)量細(xì)胞內(nèi)鈣響應(yīng)：
圖1.沒(méi)有丙磺舒的CHO-M1細(xì)胞中內(nèi)源性P2Y受體對(duì)ATP的反應(yīng)。將CHO-M1細(xì)胞在96孔黑壁/透明底板中以每100μL/孔40,000個(gè)細(xì)胞接種過(guò)夜。將100μl4μMFluo-3AM，Fluo-4AM或Cal 520 [表達(dá)] AM在HHBS中加入孔中，并將細(xì)胞在37℃下孵育2小時(shí)。用100μlHHBS替換染料加載培養(yǎng)基，加入50μl300μMATP，然后使用FITC通道用熒光顯微鏡（Olympus IX71）成像。
圖2.用Cal520或Fluo-4AM測(cè)量的CHO-K1細(xì)胞中ATP刺激的內(nèi)源性P2Y受體的鈣響應(yīng)。 在96孔黑壁/透明底板中，將CHO-K1細(xì)胞以每100μL/孔50,000個(gè)細(xì)胞接種過(guò)夜。 向細(xì)胞中加入100μL5μMFluo-4AM或具有（A）或不含（B）2.5mM丙磺舒的Cal-520 AM，并將細(xì)胞在37℃下溫育2小時(shí)。 通過(guò)FlexStation（Molecular Devices）添加ATP（50μL/孔）以達(dá)到指示的濃度。
使用鈣指示劑鹽
為了確定溶液的游離鈣濃度或單波長(zhǎng)鈣指示劑的Kd，使用以下等式：
[Ca]自由= Kd [F - Fmin] / Fmax - F]
其中F是指示劑在實(shí)驗(yàn)鈣水平下的熒光，Fmin是不存在鈣時(shí)的熒光，Fmax是鈣飽和探針的熒光。 解離常數(shù)（Kd）是探針對(duì)鈣的親和力的量度。與校準(zhǔn)溶液相比，熒光指示劑的Ca 2+結(jié)合和光譜性質(zhì)在細(xì)胞環(huán)境中變化非常顯著。細(xì)胞內(nèi)指標(biāo)的原位校準(zhǔn)通常產(chǎn)生顯著高于體外測(cè)定的Kd值。 通過(guò)在離子載體如A-23187,4-溴A-23187和離子霉素存在下將加載的細(xì)胞暴露于受控的Ca 2+緩沖液來(lái)進(jìn)行原位校準(zhǔn)。 或者，細(xì)胞透化劑如洋地黃皂苷或X-100可用于將指示劑暴露于細(xì)胞外培養(yǎng)基的受控Ca2 +水平。 表1列出了一些鈣試劑的Kd值供您參考。
使用鈣指示劑結(jié)合物
與游離離子指示劑相比，這些相同指示劑的葡聚糖綴合物表現(xiàn)出減少的區(qū)室化和低得多的染料滲漏率。由于葡聚糖的分子量，凈電荷，標(biāo)記程度和染料性質(zhì)可能影響實(shí)驗(yàn)，建議研究人員咨詢(xún)初級(jí)有關(guān)應(yīng)用興趣的信息的文獻(xiàn)。
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