鈣離子熒光探針DiBAC4(3)是一種細(xì)胞膜電位敏感的親脂性陰離子熒光染料，DIBAC4(3)本身無熒光，當(dāng)進(jìn)人細(xì)胞與胞漿內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)合后才發(fā)出熒光，DIBAC4(3)進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度增加，即膜電位增加表示細(xì)胞去極化；反之，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度降低即膜電位降低表示細(xì)胞超極化。鈣離子熒光探針DiBAC4(3)是目前*常用的線粒體膜電位檢測熒光探針。
1. 貼壁細(xì)胞
A. 取普通潔凈蓋玻片于70%乙醇中浸泡5分鐘或更長時(shí)間，無菌超凈臺(tái)內(nèi)吹干或用細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)PBS或0.9%NaCl等溶液洗滌三遍，再用細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌一遍。將蓋玻片置于六孔板內(nèi)，種入細(xì)胞培養(yǎng)過夜，使約為50%-80%滿。
B. 刺激細(xì)胞發(fā)生凋亡后，吸盡培養(yǎng)液，加入0.5ml固定液，固定10分鐘或更長時(shí)間（可4℃過夜）。
C. 去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗兩遍，每次3分鐘，吸盡液體。洗滌時(shí)宜用搖床，或手動(dòng)晃動(dòng)數(shù)次。
D. 加入0.5ml Hoechst 33258染色液，染色5分鐘。也宜用搖床，或手動(dòng)晃動(dòng)數(shù)次。
E. 用PBS或0.9%NaCl洗兩遍，每次3分鐘。
F. 滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細(xì)胞的蓋玻片，盡量避免氣泡。使細(xì)胞接觸封片液，切勿弄反。
G. 熒光顯微鏡可檢測到呈藍(lán)色的細(xì)胞核。激發(fā)波長在350nm左右，發(fā)射波長在460nm左右，詳細(xì)圖譜請(qǐng)參考下圖。
懸浮細(xì)胞
A. 離心收集細(xì)胞樣品于1.5ml離心管內(nèi)，加入0.5ml固定液，緩緩懸起細(xì)胞，固定10分鐘或更長時(shí)間（可4℃過夜）。
B. 離心去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗兩遍，每次3分鐘。洗滌期間手動(dòng)晃動(dòng)。
C. *后一次離心后吸去大部分液體保留約50ml液體，再緩緩懸起細(xì)胞，滴加至載玻片上，盡量使細(xì)胞分布均勻。
D. 稍晾干，使細(xì)胞貼在載玻片上不易隨液體流動(dòng)。
E. 均勻滴上0.5ml Hoechst 33258染色液，染色5分鐘。用吸水紙從邊緣吸去液體，微晾干。
F. 用PBS或0.9%NaCl洗兩遍，每次3分鐘。
G. 滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上一潔凈的蓋玻片，盡量避免氣泡。
H. 熒光顯微鏡可檢測到呈藍(lán)色的細(xì)胞核。激發(fā)波長在350nm左右，發(fā)射波長在460nm左.
3
組織切片
A. 對(duì)于任何常見切片，處理至常規(guī)可以進(jìn)行**染色時(shí)，或完成常規(guī)的**染色后，即可進(jìn)行后續(xù)的Hoechst染色。
B. PBS或0.9%NaCl洗兩遍，每次3分鐘，吸盡液體。洗滌時(shí)宜用搖床，或手動(dòng)晃動(dòng)數(shù)次?？稍诹装逯胁僮?。
C. 加入0.5ml Hoechst 33258染色液，染色5分鐘。也宜用搖床，或手動(dòng)晃動(dòng)。
D. 用PBS或0.9%NaCl洗兩遍，每次3分鐘。
E. 將切片置于載玻片上，滴一滴抗淬滅封片液，蓋上一潔凈的蓋玻片，盡量避免氣泡。
F. 熒光顯微鏡可檢測到呈藍(lán)色的細(xì)胞核。激發(fā)波長在350nm左右，發(fā)射波長在460nm左右，Hoechst 33258的吸收光譜和發(fā)射光譜，左側(cè)峰為吸收光譜，右側(cè)峰為發(fā)射光譜。