鈣是參與真核生理學(xué)的*普遍的離子之一，參與從骨發(fā)育到信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要過程，細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)節(jié)的紊亂可導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)和結(jié)構(gòu)并發(fā)癥。由于其重要性，鈣在細(xì)胞水平上研究是一個相對較大的主題。為了可視化和量化細(xì)胞內(nèi)鈣，研究人員采用熒光鈣指示劑（或染料），可以螯合自由漂浮的鈣離子，以產(chǎn)生定量的熒光反應(yīng)。當(dāng)與熒光顯微鏡，酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀配對時，鈣指示劑可用于成像和監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)鈣濃度。
熒光鈣指示劑可以是基因或化學(xué)工程。遺傳指標(biāo)涉及在活細(xì)胞或動物中轉(zhuǎn)染或表達(dá)GFP變體，而化學(xué)指示劑由基于BAPTA的小分子組成，其對鈣離子具有高選擇性。在這兩大類鈣指標(biāo)中，化學(xué)指標(biāo)主要受到青睞，因為它們的商業(yè)可用性，便利性和實驗設(shè)計的靈活性。
目前選擇的化學(xué)指標(biāo)中有相當(dāng)受歡迎的單波長鈣指示劑，無論它們是否與鈣結(jié)合，它們只會發(fā)出一種顏色的熒光。傳統(tǒng)的綠色熒光鈣指標(biāo)包括Fluo-3及其改良版Fluo-4。Fluo-4是由Gee及其同事在2000年開發(fā)的。它本身基本上是一種非熒光底物，但一旦與鈣結(jié)合，其熒光增加了100倍。其成像技術(shù)使研究人員能夠發(fā)現(xiàn)鈣信號傳導(dǎo)中的許多相互作用，*近，它已被廣泛應(yīng)用于基于細(xì)胞的HTS分析中，用于**發(fā)現(xiàn)。Fluo-4是Fluo-3的類似物，其中兩個氯原子被氟原子取代，
盡管Fluo-3進(jìn)行了輕微的結(jié)構(gòu)修改，但Fluo-4在產(chǎn)生更明亮和更敏感的信號方面取得了巨大進(jìn)步，使Fluo-4成為共聚焦顯微鏡，流式細(xì)胞儀和微孔板篩選應(yīng)用的理想選擇。Fluo-4的細(xì)胞滲透型Fluo-4 AM是一種流行的綠色熒光鈣指示劑，不需要對背景噪音進(jìn)行淬滅。
即使熒光增加了100倍，F(xiàn)luo-4 AM在一些領(lǐng)域也不乏問題。遇到的一個常見問題是由于電池泄漏導(dǎo)致的低信號背景比。為了解決這個問題，F(xiàn)luo系列的大多數(shù)指標(biāo)將與一種試劑配對，該試劑可防止熒光反應(yīng)離開細(xì)胞或溶解滲漏以減少背景信號。這些試劑的實例包括丙磺舒或磺胺吡喃酮抑制細(xì)胞膜中的陰離子轉(zhuǎn)運蛋白，以防止鈣的任何通過。常見的相容性表面活性劑是Pluronic®多元醇，有助于將染料溶解在水溶液中。然而，這些物質(zhì)的應(yīng)用使細(xì)胞環(huán)境受到更多侵入性操作，并且可能影響整體細(xì)胞完整性或鈣活性。為避免使用額外的試劑，可選擇Cal-520 AM。綠色染料Cal-520經(jīng)過優(yōu)化，可解決染料損失問題及其改善的細(xì)胞內(nèi)保留，因此不需要額外的試劑來保持鈣含量或抑制背景。CAL-520 在與Fluo-3和Fluo-4類似的光譜下實現(xiàn)更高的靈敏度和信號背景比。
除染料損失外，使用Fluo-4的另一個缺點是保持其使用所需的苛刻的細(xì)胞負(fù)載條件。另一種綠色染料Fluo-8可以在室溫下裝載細(xì)胞，而不是Fluo-3和Fluo-4所需的37攝氏度。由于Fluo-8的性能不依賴于溫度，因此它是HTS應(yīng)用的理想選擇。Fluo-8也以不同的解離常數(shù)（更高和更低）制備親和力）和包裝尺寸，包括HTS就緒尺寸。*后但同樣重要的是，F(xiàn)luo-8發(fā)出的信號比Fluo-4強兩倍。與Cal-520一樣，F(xiàn)luo-8與Fluo-4具有非常相似的激發(fā)和發(fā)射峰，同時是進(jìn)行綠色熒光成像的更容易獲得的通用選擇。
化學(xué)鈣指示劑的另一個麻煩的方面是它們在細(xì)胞內(nèi)分隔的傾向。一種表現(xiàn)出這種現(xiàn)象的染料是Rhod-2 AM，一種流行的紅鈣指示劑。它的凈正電荷促使許多類型的細(xì)胞中的線粒體被隔離。Rhod-2在線粒體中的這種定位在其引入細(xì)胞后不久發(fā)生，導(dǎo)致活細(xì)胞內(nèi)的熒光信號有限。Cal-590被設(shè)計為保留在細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠中，而不是其線粒體，液泡或其他細(xì)胞器，同時保留Rhod-2的光譜波長。Cal-590適用于紅色染料成像的**細(xì)胞成像。還有右旋糖酐形式鈣指示劑可用于區(qū)室化和細(xì)胞內(nèi)染料保留中更有效的測量。向染料分子中加入大分子葡聚糖允許高溶解度同時保持低毒性，這使其在與染料綴合時作為區(qū)室化或滲漏的預(yù)防是上乘的。選擇使用葡聚糖時產(chǎn)生的唯壹缺點是它必須通過貼片移液管或顯微注射注入細(xì)胞。
除了增強的熒光和改善的細(xì)胞質(zhì)保留外，Cal系列染料（Cal-520，Cal-590和Cal-630）具有用于多重檢測或多色檢測的光譜質(zhì)量。Cal-520的激發(fā)*大值保持在492，比其他綠色染料的激發(fā)*大值更接近氬激光488 nm。這種接近488 nm的特性使Cal-520可與任何熒光儀器平臺兼容。激發(fā)*大值分別為573和608 nm，發(fā)射分別為588和626 nm，紅色Cal-590和Cal-630的長波長使它們與綠色熒光蛋白（GFP）細(xì)胞系以及FITC兼容 和AlexaFluor 488標(biāo)記的抗體。