比JC-1更利于監(jiān)測(cè)活細(xì)胞中線粒體膜電位變化的熒光探針

線粒體膜電位是細(xì)胞健康和線粒體通透性轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵指標(biāo)，是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要步驟。百螢生物為您推薦AAT研發(fā)的JC-10熒光探針，它是大家熟悉的JC-1的升級(jí)、替代產(chǎn)品。

 JC-1是一種親脂性陽(yáng)離子染料，廣泛用于檢測(cè)線粒體去極化。 然而，其極差的水溶性使其即使在1μM濃度下也在水性緩沖液中沉淀。 這種不利的性質(zhì)使得JC-1難以用于某些生物學(xué)應(yīng)用，特別是對(duì)于基于圖像和熒光酶標(biāo)儀的應(yīng)用，其中非常需要完全去除未溶解的熒光顆粒以獲得準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。

研發(fā)JC-10是為了改善JC-1的水溶性差。與JC-1相比，JC-10具有更好的水溶性。與JC-1的特性一致，JC-10能夠選擇性地進(jìn)入線粒體，并且當(dāng)膜電位增加時(shí)，其顏色可逆地從綠色變?yōu)槌壬＿@種性質(zhì)是由于膜極化時(shí)JC-10聚集體的可逆形成這導(dǎo)致發(fā)射光從520nm（即JC-10單體形式的發(fā)射）轉(zhuǎn)變?yōu)?70nm（即J聚集體的發(fā)射）。當(dāng)在490nm處激發(fā)時(shí)，隨著線粒體膜變得更加極化，JC-10的顏色從綠色橙色可逆地變?yōu)榫G色橙色。可以使用流式細(xì)胞儀，顯微鏡和酶標(biāo)儀中常用的過(guò)濾器檢測(cè)兩種熒光顏色。對(duì)于流式細(xì)胞儀，可以在熒光通道1（FL1）中分析綠色發(fā)射，在通道2（FL2）中分析綠色橙色發(fā)射。除了在流式細(xì)胞儀中的潛在用途外，JC-10還可用于熒光成像和熒光酶標(biāo)儀平臺(tái)，其中JC-1由于其水溶性差而未被廣泛使用。

AAT相繼研發(fā)了一種檢測(cè)試劑盒，可以使用JC-10通過(guò)酶標(biāo)儀（而不是流式細(xì)胞儀）監(jiān)測(cè)線粒體膜電位。 JC-10在幾種不同細(xì)胞類(lèi)型（例如，原代大鼠肝細(xì)胞，CHO-K1，HeLa，Jurkat和HepG2細(xì)胞系）中優(yōu)于JC-1。在熒光板酶標(biāo)儀和熒光顯微鏡上進(jìn)行各種數(shù)據(jù)的觀察和檢測(cè)。 在大多數(shù)細(xì)胞系中，JC-10具有優(yōu)異的信號(hào)與背景比。

以下是JC-10在CHO-M1，Hela，HepG2和Jurkat細(xì)胞中的實(shí)驗(yàn)實(shí)例

JC-10是一種新型熒光探針，可用于以與JC-1相似的機(jī)制檢測(cè)線粒體膜電位變化。 與JC-1相比，JC-10具有以下優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)：

易于使用：當(dāng)稀釋到水性緩沖液中時(shí)，JC-10不會(huì)沉淀，從而消除偽影。

穩(wěn)定：JC 10具有較小的分析偏差，因?yàn)樗哂懈叩乃苄院透叩撵`敏度。

信號(hào)強(qiáng)度高：在大多數(shù)測(cè)試細(xì)胞系中，JC-10具有比JC-1更高的信號(hào)背景比和更高的靈敏度。

廣泛應(yīng)用：JC-10可用于原代大鼠肝細(xì)胞。

適用儀器多樣化：JC-10與熒光板酶標(biāo)儀，細(xì)胞成像儀和流式細(xì)胞儀兼容。

圖1.在JurKat細(xì)胞中由JC-10和JC-1監(jiān)測(cè)的喜樹(shù)堿誘導(dǎo)的線粒體膜電位變化。 用10μM喜樹(shù)堿處理Jurkat細(xì)胞4小時(shí)。 將JC-1和JC-10染料加載溶液加入孔中30分鐘。 使用熒光顯微鏡（Olympus IX71）使用具有20X物鏡的FITC和TRITC通道獲得的圖像。

圖2.使用JC-10或JC-1的CHO-K1，Hela和HepG2細(xì)胞系中的FCCP劑量反應(yīng)。 將CHO-K1，Hela和HepG2細(xì)胞在96孔黑壁/透明底板中以每100μl/孔30,000個(gè)細(xì)胞接種過(guò)夜。從平板中除去生長(zhǎng)培養(yǎng)基，向每個(gè)孔中加入100μL10μM的JC-10或JC-1。 將細(xì)胞在37℃下染色30分鐘。 FlexStation添加FCCP以達(dá)到*終指定濃度。

圖3.使用JC-10或JC-1的Hela細(xì)胞中的FCCP，寡霉素和星形孢菌素劑量反應(yīng)（終點(diǎn)測(cè)定）。 將Hela細(xì)胞在96孔黑壁/透明底板中以每100μl/孔20,000個(gè)細(xì)胞接種過(guò)夜。 細(xì)胞用50μL：A）FCCP處理30分鐘，B）Olygomycin處理30分鐘，和C）Staurosporine在血清饑餓18小時(shí)后處理5小時(shí)。 每孔加入50μL20μMJC-10或JC-1。 將細(xì)胞在37℃下染色30分鐘。 FlexStation記錄熒光信號(hào)。

圖4.通過(guò)使用JC-10或JC-1在原代大鼠肝細(xì)胞中的FCCP或纈氨霉素劑量反應(yīng)（動(dòng)力學(xué)與終點(diǎn)測(cè)定）。 根據(jù)制造商的建議將原代大鼠肝細(xì)胞接種在96孔板上。 A）動(dòng)力學(xué)測(cè)定：通過(guò)FlexStation添加FCCP以達(dá)到*終指示的濃度。 B）終點(diǎn)測(cè)定：用纈氨霉素處理細(xì)胞30分鐘。 FlexStation記錄熒光信號(hào)。 通過(guò)SoftMaxPro計(jì)算綠色和紅色熒光強(qiáng)度的比率。

圖5. JC-10和JC-1比較用于監(jiān)測(cè)JOTKat細(xì)胞中喜樹(shù)堿誘導(dǎo)的線粒體膜電位變化。 用10μM喜樹(shù)堿處理Jurkat細(xì)胞4小時(shí)。 將JC-1和JC-10染料加載溶液加入相應(yīng)的孔中30分鐘。 用BMG NOVOstar酶標(biāo)儀在Ex 485nm / Em 520和595nm下測(cè)量J-聚集體和單體形式的JC-1和JC-10的熒光強(qiáng)度。

圖6.使用JC-10對(duì)FCCP誘導(dǎo)的線粒體膜電位變化的影響的流式細(xì)胞術(shù)分析。 將Jurkat細(xì)胞與DMSO（上圖）或5μMFCCP（低）一起用JC-10溶液染色加載10分鐘。使用FL1和FL2通道，用FACSCalibur（Becton Dickinson，San Jose，CA）流式細(xì)胞儀測(cè)量J聚集體和單體形式JC-10的熒光強(qiáng)度。 未補(bǔ)償數(shù)據(jù)（左欄）與補(bǔ)償數(shù)據(jù)進(jìn)行比較（右欄）

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