一種優(yōu)異的定量分析晚期細(xì)胞凋亡中的DNA片段的方法

今天百螢生物帶您了解一種可以檢測晚期細(xì)胞凋亡中DNA片段的方法。隨著科學(xué)的進(jìn)步，人們發(fā)現(xiàn)多細(xì)胞生物由高度有組織的細(xì)胞群組成，而重要的是多細(xì)胞生物擁有復(fù)雜的細(xì)胞過程，如細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡建立穩(wěn)態(tài)。任何一個(gè)過程的不適當(dāng)轉(zhuǎn)變都會(huì)導(dǎo)致**。例如，神經(jīng)元中細(xì)胞凋亡活性的增加是各種神經(jīng)退行性**如阿爾茨海默氏病和帕金森病的根源。相反，細(xì)胞凋亡機(jī)制的喪失可導(dǎo)致過度的細(xì)胞生長，這是細(xì)胞如何變成癌癥的潛在機(jī)制?？傮w而言，細(xì)胞凋亡在**中的作用是一項(xiàng)很熱門的科學(xué)研究。

細(xì)胞凋亡是復(fù)雜且精心編排的程序性細(xì)胞死亡的途徑。這種細(xì)胞自主過程的特征在于幾種不同的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)標(biāo)記，包括細(xì)胞和核收縮，染色質(zhì)濃縮，細(xì)胞質(zhì)膜起泡和核DNA片段化。這些形態(tài)變化都源于兩種凋亡途徑：外在或內(nèi)在途徑。外在途徑是由細(xì)胞外死亡受體配體（例如腫瘤壞死因子（TNF）或Fas配體（FasL））激活的受體介導(dǎo)的途徑。內(nèi)源性途徑由環(huán)境應(yīng)激物在細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)，導(dǎo)致線粒體膜透化和凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）和細(xì)胞色素c的釋放。來自兩種途徑的信號通過caspase級聯(lián)反應(yīng)，*終導(dǎo)致caspase激活的蛋白酶下游消化DNA。細(xì)胞凋亡的這些特征允許使用DNA片段化測定法作為鑒定細(xì)胞凋亡的*終決定因素。

圖1.概述了細(xì)胞凋亡中涉及的所有參數(shù)。這些事件的發(fā)生是無序的，它們中的許多將重疊并且經(jīng)常同時(shí)發(fā)生。事件1至4是細(xì)胞凋亡的生物化學(xué)特征，其不一定以細(xì)胞死亡結(jié)束。下游細(xì)胞凋亡事件5至8是細(xì)胞已經(jīng)致力于細(xì)胞凋亡的強(qiáng)有力指標(biāo)，之后細(xì)胞不太可能存活。

1 膜不對稱性喪失                                                             5 G1細(xì)胞周期亞群增加

2 促凋亡Bcl-2蛋白的激活                                                6 核固縮

3 caspase激活                                                                 7 DNA片段化

4 線粒體膜電位的喪失和細(xì)胞色素c的釋放                        8 細(xì)胞膜破裂

檢測DNA片段化的凋亡檢測

有各種技術(shù)用于評估和鑒定凋亡DNA片段化。*早的測定是基于凝膠的DNA梯度測定，其涉及使用瓊脂糖凝膠電泳來可視化和分離DNA片段。細(xì)胞凋亡的DNA片段化由一種獨(dú)特的“梯狀”模式表示，核小體片段的長度約為180-200個(gè)堿基對。盡管有效地生成定性數(shù)據(jù)，但該技術(shù)不易適應(yīng)高吞吐量使用。

另一種檢測方法采用雙抗體夾心ELSIA試驗(yàn)，該試驗(yàn)由抗DNA和抗組蛋白抗體組成，以在凋亡過程中顯現(xiàn)DNA片段化。盡管該測定法在檢測凋亡DNA片段方面明顯更敏感并且適合于高通量用途（例如化合物篩選），但是它是勞動(dòng)密集型的并且抗體的使用是昂貴的。

TUNEL分析

1992年，Gorczyca等人。1992年引入了一種利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）和切口平移或TUNEL測定法測量細(xì)胞凋亡DNA片段化的新方法。TdT催化熒光團(tuán)標(biāo)記的脫氧尿苷三磷酸（dUTP）加入到DNA雙鏈斷裂（DSB）的3'-羥基末端。

自引入TUNEL試驗(yàn)以來，它已成為一種廣泛接受的原位技術(shù)，用于鑒定凋亡細(xì)胞死亡。與以前的方法相比，TUNEL分析更靈敏，能夠在幾個(gè)數(shù)量級上進(jìn)行廣泛的定量測量。多年來，TUNEL技術(shù)已針對生色和熒光檢測方法進(jìn)行了調(diào)整和優(yōu)化。顯色TUNEL測定利用與生物素綴合的dUTP和酶標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白進(jìn)行高靈敏度染色。熒光檢測方法依賴于熒光染料偶聯(lián)的dUTP，其用于直接檢測DNA片段化。

幾個(gè)變量影響TUNEL測定的染色動(dòng)力學(xué)。這些變量中的一些包括試劑濃度，樣品固定和DNA鏈斷裂的可及性，其可在組織或細(xì)胞樣品類型之間變化。因此，標(biāo)準(zhǔn)化您選擇的TUNEL檢測并進(jìn)行適當(dāng)?shù)目刂茖τ跀?shù)據(jù)收集和解釋至關(guān)重要。

Cell Meter?TUNEL細(xì)胞凋亡檢測

AAT Bioquest的Cell Meter?TUNEL細(xì)胞凋亡檢測針對熒光檢測進(jìn)行了優(yōu)化，可提供綠色或紅色熒光發(fā)**色。AAT Bioquest的Cell Meter?Assays包括所有必需成分和強(qiáng)大的方案，用于檢測和定量細(xì)胞中的凋亡DNA片段化。通過使用TdT將熒光染料修飾的脫氧尿苷5'-三磷酸核苷酸Tunnelyte TM Green或Tunnelyte TM Red催化摻入DNA的3'OH末端來實(shí)現(xiàn)測量凋亡DNA片段。然后可以通過流式細(xì)胞術(shù)定量標(biāo)記的DNA片段或通過熒光顯微鏡直接觀察。

圖2.用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的化學(xué)物質(zhì)，星形孢菌素（SS）處理的HeLa細(xì)胞中TUNEL反應(yīng)的熒光圖像。與未處理的對照相比，用100nM或1μMSS處理HeLa細(xì)胞4小時(shí)。將細(xì)胞與反應(yīng)混合物在37℃溫育1小時(shí)。使用具有FITC濾光器組的熒光顯微鏡分析綠色熒光信號。熒光標(biāo)記的DNA鏈斷裂在SS處理的細(xì)胞中顯示出強(qiáng)烈的熒光染色。

Tunnelyte?Green在497 nm處的峰值吸收非常適合配備488 nm氬離子激光器的儀器進(jìn)行高效激發(fā)。使用氦氖激光器的儀器可有效激發(fā)Tunnelyte?Red在547 nm處的峰值吸收。對于發(fā)射濾光片選擇，可分別使用FITC（530/30）或Cy5（660/40）濾光片讀取Tunnelyte?Green或Tunnelyte?Red。由于Tunnelyte?核苷酸與藍(lán)色光譜充分分離，因此DAPI，Hoechest或Nuclear Violet?LCS1等染色劑適用于多色熒光應(yīng)用中的活細(xì)胞復(fù)染。

圖3.Tunnelyte?Green的吸收和發(fā)射光譜。激發(fā)波長為488nm（藍(lán)色激光線）。Tunnelyte?綠色讀數(shù)帶有發(fā)射濾光片F(xiàn)ITC（綠色波段）。

圖4：Tunnelyte?Red的吸收和發(fā)射光譜。激發(fā)波長為561 nm（綠色激光線）。使用發(fā)射濾光片Cy5（紅色波段）讀取Tunnelyte?紅色。

我們的Cell Meter?TUNEL細(xì)胞凋亡檢測與其他市售TUNEL檢測相比具有明顯的優(yōu)勢，因?yàn)槲覀兊脑噭┖性诜磻?yīng)緩沖液中不含有二甲胂酸鈉或鉀。消除二甲胂酸鈉具有雙重益處。首先，處理起來要**得多。其次，它提供了更靈敏和準(zhǔn)確的細(xì)胞凋亡檢測。二甲胂酸鈉是一種致癌的砷衍生物，通過攝入，吸入或皮膚接觸而具有高毒性。

實(shí)驗(yàn)流程

用測試化合物制備細(xì)胞

用4％甲醛固定細(xì)胞

用37℃的反應(yīng)混合物孵育1小時(shí)

洗滌并在Ex / Em = 550/590 nm處分析細(xì)胞

注意：在室溫下解凍組分C，使用前將組分A和B保存在冰上。

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AAT Bioquest的Cell Meter?TUNEL檢測試劑盒為檢測細(xì)胞凋亡DNA片段提供了一種簡單，**且靈敏的方法。熒光核苷酸的直接摻入通過減少所需的孵育步驟數(shù)量來減少測定時(shí)間，這允許更快地標(biāo)記片段化DNA。*后，我們的試劑不含二甲胂酸鈉，這使得我們的TUNEL實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的廢物更容易處理。

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