1.為什么我的總NAD / NADH讀數(shù)與我的各個(gè)NAD / NADH讀數(shù)的總數(shù)不匹配？
答：導(dǎo)致這種情況的*可能原因是NADH提取物讀數(shù)不準(zhǔn)確。根據(jù)初始NAD濃度，NADH提取液可能無(wú)法從樣品孔中消除所有NAD，這意味著某些NAD將保留并混淆讀數(shù)?？紤]到檢測(cè)探針是高度敏感的，即使很小的殘留NAD也會(huì)影響熒光測(cè)量。這就是為什么我們建議用戶測(cè)量總NAD / NADH和NAD提取物的原因。然后從那里可以將NADH濃度計(jì)算為總NAD / NADH減去NAD提取物。通常，這將對(duì)濃度以及NAD / NADH比值進(jìn)行更準(zhǔn)確的測(cè)量。
2.Amplite?熒光NAD / NADH比率測(cè)定試劑盒*紅色熒光*是否可以與NADP / NADPH一起使用？該試劑盒可以測(cè)量NADP +和NADPH嗎？
答：不，此套件無(wú)法測(cè)量NADP / NADPH。但是，我們確實(shí)提供了另一種試劑盒，可以定量NADP / NADPH比率。參見(jiàn)Amplite?熒光NADP / NADPH比率檢測(cè)試劑盒*紅色熒光*
3.Amplite?熒光NAD / NADH比率測(cè)定試劑盒*紅色熒光*是否可用于植物細(xì)胞？**細(xì)胞？哺乳動(dòng)物細(xì)胞？用于組織樣本？
答：是的，該試劑盒可用于植物，**，哺乳動(dòng)物和組織細(xì)胞樣品。每種細(xì)胞類型的制備指南如下：
植物細(xì)胞樣品：
用200 mg / mL的裂解緩沖液勻漿葉子，并以2500 rpm離心5-10分鐘，使用上清液進(jìn)行測(cè)試。
**細(xì)胞樣品：
離心收集**細(xì)胞（（10,000 g，0°C，15分鐘）。使用約100至1000萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/ mL裂解液，將處理過(guò)的溶液在室溫下放置15分鐘，以2500 rpm離心5分鐘后，用上清進(jìn)行測(cè)試。
哺乳動(dòng)物細(xì)胞樣品：
從板孔中除去培養(yǎng)基，每1-5百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞使用約100 μL裂解緩沖液（或在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中為50-100 μL /孔），并將處理過(guò)的溶液在室溫下放置15分鐘。直接使用細(xì)胞裂解液或以1500 rpm離心5分鐘，將上清液用于測(cè)試。
組織樣品：
稱量約20 mg組織，用冷PBS洗滌。在微量離心管中用400 μL裂解緩沖液勻漿。以2500 rpm離心5-10分鐘，將上清液用于測(cè)定。
4.Amplite?熒光NAD / NADH比率測(cè)定試劑盒*紅色熒光* pH敏感嗎？我是否必須在特定的pH緩沖液中準(zhǔn)備樣品？pH值會(huì)影響我的熒光讀數(shù)嗎？
答：pH是NAD或NADH萃取步驟中的一個(gè)因素。NADH提取步驟（和相應(yīng)的緩沖液，組分D）是堿性的（pH> 7），而NAD提取步驟（和相應(yīng)的緩沖液，組分E）是酸性的（pH <7）。此外，與大多數(shù)熒光探針一樣，我們的NADH傳感器對(duì)pH敏感。讀數(shù)應(yīng)在中性條件下（pH≈7）進(jìn)行。
5.典型的NAD與NADH比率是多少？
答：在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，總NAD / NADH比率通常被引用為10：1，而游離細(xì)胞質(zhì)NAD / NADH比率估計(jì)約為725：1。
6.NADH和ROS是否相關(guān)？
答：活性氧（ROS）是涉及氧化還原反應(yīng)的多種細(xì)胞途徑的潛在破壞性生化副產(chǎn)物，其中*主要的貢獻(xiàn)者是輔酶NAD +和NADP促進(jìn)的能量途徑。這些輔酶的還原形式用于ROS的**，各種ROS本身以臨時(shí)方式用于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)。目前在細(xì)胞中約有 400個(gè)已知的涉及NAD + / NADH的氧化還原反應(yīng)，另外約30個(gè)涉及磷酸化的NADP / NADPH的氧化還原反應(yīng)。這些分子的深遠(yuǎn)影響使得它們的測(cè)量和可視化即使在看似無(wú)關(guān)的實(shí)驗(yàn)中也很有用
7.如何為Amplite?熒光NAD / NADH比分析試劑盒*紅色熒光*制備/裂解細(xì)胞樣品？
答：提供了裂解緩沖液（組分G）。您可以使用《細(xì)胞樣品制備方案》中概述的樣品制備指南。
8.我能在不裂解細(xì)胞的情況下測(cè)量NADPH嗎？
答：大多數(shù)傳統(tǒng)的印跡和蛋白質(zhì)檢測(cè)方法都涉及細(xì)胞裂解物，但近年來(lái)，已開(kāi)發(fā)出新的探針，可以可視化活細(xì)胞中NADP + / NADPH的水平。細(xì)胞內(nèi)探針將使研究人員無(wú)需進(jìn)行細(xì)胞裂解步驟即可進(jìn)行測(cè)量。對(duì)于多參數(shù)實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)選擇處于極端波長(zhǎng)的熒光團(tuán)，以減少光譜重疊和數(shù)據(jù)校正的必要性。
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