細(xì)胞膜熒光探針DIR是一種細(xì)胞膜電位敏感的親脂性陰離子熒光染料，DIBAC4(3)本身無熒光，當(dāng)進(jìn)人細(xì)胞與胞漿內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)合后才發(fā)出熒光，DIBAC4(3)進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度增加，即膜電位增加表示細(xì)胞去極化；反之，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度降低即膜電位降低表示細(xì)胞超極化。DiBAC4(3)是目前*常用的線粒體膜電位檢測(cè)熒光探針。
1. 染色液制備
（1）配置DMSO或EtOH 儲(chǔ)存液：儲(chǔ)存液用 DMSO或EtOH配置濃度1～5 mM。
【注】未使用的儲(chǔ)存液分裝儲(chǔ)存在-20℃，避免反復(fù)凍融。
（2）工作液制備：細(xì)胞膜熒光探針DIR用合適的緩沖液（如：無血清培養(yǎng)基，HBSS或PBS）稀釋儲(chǔ)存液，配制濃度為1～5 μM的工作液。
【注】工作液*終濃度建議根據(jù)不同細(xì)胞系和實(shí)驗(yàn)體系來優(yōu)化。
2. 懸浮細(xì)胞染色
（1）加入細(xì)胞膜熒光探針DIR適當(dāng)體積的染色工作液重懸細(xì)胞，使其密度為1×106/mL。
（2）37 ℃孵育細(xì)胞 2～20min，不同的細(xì)胞*佳培養(yǎng)時(shí)間不同?？梢?0min作為起始孵育時(shí)間，之后優(yōu)化體系以得到均一的標(biāo)記結(jié)果。
（3）孵育結(jié)束，按1000～1500 rpm離心5min。
（4）傾倒上清液，再次緩慢加入37℃預(yù)熱的生長(zhǎng)培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。
（5）重復(fù)（3），（4）步驟兩次以上。
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