|
1.根據(jù)您的特定方案，將細(xì)胞培養(yǎng)至*佳密度以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡
對于在96孔微孔板培養(yǎng)物中生長的貼壁細(xì)胞，我們推薦約30,000至50,000個細(xì)胞/孔，對于非貼壁細(xì)胞，推薦約1至2×106個細(xì)胞/ mL。 同時，對每種標(biāo)記，都需要使用陰性對照。 以下是一些誘導(dǎo)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞凋亡的例子：
1）用2μg/ ml喜樹堿處理Jurkat細(xì)胞3小時。
2）用1μM星形孢菌素處理Jurkat細(xì)胞3小時。
3）用4μg/ ml喜樹堿處理HL-60細(xì)胞4小時。
4）用1μM星形孢菌素處理HL-60細(xì)胞4小時。
2.固定和染色
2.1移除細(xì)胞培養(yǎng)基。
2.2向每個孔中加入100μL/孔/ 96孔板的4％甲醛固定緩沖液（未提供）。
注意：對于非貼壁細(xì)胞，添加所需量（如2 x 106個細(xì)胞/ mL）的4％甲醛固定緩沖液。
2.3在室溫下孵育板20至30分鐘。
2.4去除固定劑。
可選：如果需要，在固定后加入100μL/孔/ 96孔板的透化試劑（0.2％Triton X-100，在PBS中，未提供），并在室溫下孵育平板10分鐘。
2.5用PBS洗滌細(xì)胞2-3次。
可選：您也可以使用DNAase I通過在室溫下用DNA酶I消化細(xì)胞30分鐘來制備TUNEL反應(yīng)的陽性對照，然后進行TUNEL反應(yīng)（步驟3）
3.TUNEL反應(yīng)
3.1根據(jù)待測樣品的數(shù)量，在使用前準(zhǔn)備反應(yīng)混合物（見說明書）
3.2將50μL反應(yīng)混合物（來自步驟3.1）加入每個孔或管中，并在37℃下孵育60分鐘。
3.3取出反應(yīng)混合物，用200μL/孔的PBS洗滌細(xì)胞3-5次。
4.通過熒光顯微鏡，流式細(xì)胞儀或熒光酶標(biāo)儀在Ex / Em = 550 / 590nm處監(jiān)測熒光強度。
5.可選：用1X Hoechst（組分C，Ex / Em = 350 / 460nm）染色細(xì)胞核用于圖像分析。
|