細(xì)胞膜熒光探針DIR化學(xué)性質(zhì) 熒光定量PCR(細(xì)胞膜熒光探針DIR)所使用的熒光化學(xué)制劑可分為兩種：熒光探針和熒光染料。PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’－3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。
實(shí)時(shí)熒光PCR(細(xì)胞膜熒光探針DIR)技術(shù)靶基因的確定及引物和探針的設(shè)計(jì)原則
1．靶基因的確定：選擇檢測(cè)組共有的基因以避**測(cè)的假陰性(漏檢)。
2．檢測(cè)片段的確定：選擇檢測(cè)組內(nèi)的保守 (突變少)（避免假陰性）、組間特異的序列 (突變多)（避免假陽(yáng)性）作為引物探針的設(shè)計(jì)位置。片段長(zhǎng)度70-150bp。
3．引物：長(zhǎng)度17-25bp;GC含量30-80%；退火溫度(Tm值)58-60℃；避免穩(wěn)定的引物二聚體（特別是多聯(lián)檢測(cè)）及發(fā)夾結(jié)構(gòu)(自由能大于-3.5kc/m)；序列不能出現(xiàn)連續(xù)的G，3’端避免G或C，*后5個(gè)堿基內(nèi)避免兩個(gè)以上的G或C。
4．探針：長(zhǎng)度20-30bp（Taqman)或16-25bp(MGB)；GC含量30-80%；Tm值為68-70℃；避免穩(wěn)定的二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu) (自由能大于-3.5kc/m)；5’端不能是G；位置盡量靠近上游引物；選擇波長(zhǎng)差異較大（多聯(lián)檢測(cè)）或Fam(單聯(lián)檢測(cè)）的熒光標(biāo)記。
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