今天百螢給大家系統(tǒng)的介紹一下AAT Bioquest的鈣離子熒光探針。AAT Bioquest研發(fā)的鈣離子探針與其他市售的鈣離子熒光探針的區(qū)別是什么？有什么優(yōu)勢(shì)？以及探針的更新及發(fā)展歷程等。感興趣的朋友一起看看吧！
鈣離子指示劑的發(fā)展歷程
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產(chǎn)品名稱
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研發(fā)時(shí)間
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研發(fā)公司
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產(chǎn)品特點(diǎn)
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圖示
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Fluo-3
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1987
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Roger Tsien
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**款鈣離子熒光探針
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圖1.各類熒光探針熒光強(qiáng)度對(duì)比圖
圖2.鈣離子熒光探針在細(xì)胞內(nèi)的工作原理
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Fluo-4
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1996
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ThermoFisher
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比Fluo-3的熒光更亮
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Fluo-8
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2008
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AAT Bioquest
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與Fluo-4相比：
1.擁有更亮的熒光
2.易于細(xì)胞加載
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Cal-520
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2014
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AAT Bioquest
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與Fluo-4相比：
1.擁有更長(zhǎng)的細(xì)胞內(nèi)保留時(shí)間
2.更高的信噪比
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Calbryte-520
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2017
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AAT Bioquest
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與其他產(chǎn)品相比：
1.它擁有*亮的熒光
2.它擁有*長(zhǎng)的細(xì)胞內(nèi)保留時(shí)間
3.更高的信噪比
4.更容易加載
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Fluo-8
在Fluo-8的研發(fā)之前，F(xiàn)luo-3、Fluo-4已廣泛用于流式細(xì)胞術(shù)和酶標(biāo)儀（如：FLIPR）上的鈣離子檢測(cè)，但是，弱熒光信號(hào)和苛刻的染料上樣條件限制了它們?cè)谀承┘?xì)胞分析中的應(yīng)用。而Fluo-8的研發(fā)正好解決了Fluo-3和Fluo-4的這些局限性。
Fluo-3和Fluo-4在細(xì)胞應(yīng)用中*重要的性質(zhì)是它們的吸收光譜與氬離子激光源488nm處的激發(fā)兼容，并且響應(yīng)于Ca2+結(jié)合，熒光強(qiáng)度大大增強(qiáng)。我們的Fluo-8 鈣離子檢測(cè)試劑保留了這兩個(gè)優(yōu)良的特性。Fluo-8試劑的吸收和發(fā)射峰分別為490nm和514nm。在488nm的氬離子激光作用下，它們能得到很好的激發(fā)，其發(fā)射熒光（514nm）隨Ca2+濃度的增加而增加。Fluo-8與Ca2+結(jié)合后熒光強(qiáng)度增加200倍以上。由于刺激后許多細(xì)胞內(nèi)Ca2+的增加幅度通常是5-10倍，因此Fluo-8是Fluo-3和Fluo-4的**替代品。Fluo-8的Kd估計(jì)為389nm（22°C，pH7.0–7.5），但該值可能受到pH、粘度和體內(nèi)結(jié)合蛋白的影響。
表1.Fluo-8鈣離子檢測(cè)試劑的光譜和Ca2+結(jié)合特性
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Ca2+ 熒光探針
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激發(fā)（Ex）
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發(fā)射（Em）
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Ca2+結(jié)合的Kd
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Fluo-8
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490 nm
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514 nm
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389 nM
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Fluo-8H
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490 nm
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514 nm
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232 nM
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Fluo-8L
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490 nm
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514 nm
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1.86 uM
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Fluo-8產(chǎn)品特點(diǎn)：
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方便檢測(cè)的波長(zhǎng):*大激發(fā)490 nm；*大發(fā)射514 nm。
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熒光強(qiáng)度高：比Fluo-4 AM高2倍；比Fluo-3 AM高4倍。
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更快的加載:在室溫下（而不是Fluo-4 AM所需的37oC）加載染料。
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多功能Ca2+結(jié)合Kd如表1所示。
圖3.將U2OS細(xì)胞以40000細(xì)胞/100ul/孔在96孔板中培養(yǎng)過(guò)夜。去掉生長(zhǎng)培養(yǎng)基，將細(xì)胞分別與100ul的Fluo-3 AM、Fluo-4 AM和Fluo-8AM在HHBS中以4 uM的濃度在37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1小時(shí)。用200ulHHBS洗滌細(xì)胞兩次，然后使用FITC通道用熒光顯微鏡（Olympus IX71）成像。
Fluo-8相關(guān)產(chǎn)品：
Cal-520、Cal-590、Cal-630
Cal-520，Cal-590和Cal-630提供了*強(qiáng)大的基于均相熒光的檢測(cè)工具，用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣動(dòng)員。它們是熒光鈣敏感染料，與現(xiàn)有的鈣指示劑（如Fluo-3 AM，F(xiàn)luo-4 AM和Rhod-2 AM）相比，具有明顯改善的信噪比和細(xì)胞內(nèi)滯留性。一旦進(jìn)入細(xì)胞，Cal520 AM，Cal-590 AM或Cal-630 AM的親脂性基團(tuán)就會(huì)被細(xì)胞內(nèi)酯酶裂解，從而產(chǎn)生帶負(fù)電荷的熒光染料，并留在細(xì)胞內(nèi)部。與鈣離子結(jié)合后，它們的熒光大大增強(qiáng)。當(dāng)細(xì)胞被激動(dòng)劑刺激時(shí)，該受體會(huì)發(fā)出細(xì)胞內(nèi)鈣釋放的信號(hào)，從而增加Cal-520，Cal-590或Cal-630的熒光。 Cal-520 AM，Cal-590 AM或Cal-630 AM的高靈敏度超過(guò)100倍的熒光增強(qiáng)特性使其成為測(cè)量細(xì)胞鈣的理想指標(biāo)。高信噪比和更好的細(xì)胞內(nèi)保留能力使Cal-520，Cal-590或Cal-630鈣測(cè)定成為評(píng)估GPCR和鈣通道靶標(biāo)以及篩選其激動(dòng)劑和拮抗劑的強(qiáng)大工具。
表2.Cal-520，Cal-590或Cal-630 Ca2+檢測(cè)試劑的光譜和Ca2+結(jié)合特性
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Ca2+ 熒光探針
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激發(fā)（Ex）
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發(fā)射（Em）
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Kd (nM)
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Cal-520
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492 nm
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514 nm
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320
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Cal-590
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558 nm
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584 nm
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561
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Cal-630
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607 nm
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623 nm
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792
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圖4.不含丙磺舒的CHO-M1細(xì)胞中內(nèi)源性P2Y受體對(duì)ATP的反應(yīng)。 將CHO-M1細(xì)胞以每100 μL 40,000個(gè)細(xì)胞的孔接種在黑色96孔板中過(guò)夜。 將HHBS中的100 μl 4 μM Fluo-3 AM，F(xiàn)luo-4 AM或Cal520 AM加入孔中，并將細(xì)胞在37°C下孵育2小時(shí)。 將染料加載介質(zhì)替換為100 μl HHBS，添加50 μl 300 μM ATP，然后使用FITC通道在熒光顯微鏡（Olympus IX71）上成像。
圖5.用Cal-520或Fluo-4 AM測(cè)量的CHO-K1細(xì)胞中內(nèi)源性P2Y受體的ATP刺激鈣反應(yīng)。 將CHO-K1細(xì)胞以每100 μL每孔50,000個(gè)細(xì)胞在黑色96孔板上接種過(guò)夜。 將100 μL 5 μM Fluo-4 AM和帶有（A）或不帶有（B）2.5 mM丙磺舒的Cal-520AM加入細(xì)胞中，并將細(xì)胞在37℃下孵育2小時(shí)。 通過(guò)FlexStation（分子設(shè)備）添加ATP（50 μL /孔）以達(dá)到*終指示的濃度。
圖6.CHO-K細(xì)胞中內(nèi)源性P2Y受體對(duì)ATP的反應(yīng)。 將CHO-K細(xì)胞以每100 μL 40,000個(gè)細(xì)胞的孔接種在黑色96孔板中過(guò)夜。 將含有1 mM丙磺舒的HHBS中的100 μl 4 μM Cal 590 AM或Cal 630 AM加到孔中，并將細(xì)胞在37°C下孵育2小時(shí)。 將染料上樣介質(zhì)替換為100 μl HHBS和1 mM丙磺舒，然后在添加50 μl 300 μM ATP之前和之后使用TRITC通道用熒光顯微鏡（Olympus IX71）成像。
Cal-520、Cal-590、Cal-630相關(guān)產(chǎn)品：
Calbryte 520、Calbryte 590、Calbryte 630
Calbryte 520，Calbryte 590和Calbryte 630為檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣動(dòng)員提供了*強(qiáng)大的均相熒光分析工具。與現(xiàn)有的鈣指示劑（例如Fluo-3 AM，F(xiàn)luo-4 AM和Rhod-2 AM）相比，這些對(duì)鈣敏感的染料明顯更亮，并提供更高的信噪比，并大大改善了細(xì)胞內(nèi)保留和負(fù)載效率。一旦進(jìn)入細(xì)胞，Cal520 AM，Calbryte 590 AM或Calbryte 630 AM的親脂性阻斷性AM基團(tuán)就會(huì)被細(xì)胞內(nèi)酯酶裂解，產(chǎn)生帶負(fù)電荷的熒光Calbryte 染料，并留在細(xì)胞內(nèi)。與鈣結(jié)合后，它們的熒光大大增強(qiáng)。當(dāng)細(xì)胞受到激動(dòng)劑刺激時(shí)，該受體發(fā)出信號(hào)通知細(xì)胞內(nèi)鈣的釋放，從而明顯增加Calbryte 520，Calbryte 590或Calbryte 630的熒光。高靈敏度和大于100倍的熒光增強(qiáng)特性使Calbryte 520 AM， Calbryte 590 AM或Calbryte 630 AM是測(cè)量細(xì)胞內(nèi)鈣的*強(qiáng)指示劑。
表3. Calbryte 520，Calbryte 590和Calbryte 630試劑的光譜和Ca2+結(jié)合特性。
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Ca2+ 熒光探針
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激發(fā)（Ex）
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發(fā)射（Em）
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Kd (μM)
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Calbryte 520
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492 nm
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514 nm
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1.2
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Calbryte 590
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580 nm
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592 nm
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1.4
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Calbryte 630
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608 nm
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624 nm
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1.2
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圖7. CHO-K1細(xì)胞中內(nèi)源性P2Y受體對(duì)ATP的反應(yīng)。 將CHO-K1細(xì)胞以每100 μL 40,000個(gè)細(xì)胞的孔接種在黑色96孔板中過(guò)夜。 將含有丙磺舒的HHBS中的100 μL Fluo-4 AM或Calbryte 520 AM加入孔中，并將細(xì)胞在37°C下孵育45分鐘。 將染料加載介質(zhì)替換為200 μL HHBS，添加50 μL 50 μM ATP，并使用FITC通道在熒光顯微鏡（Keyence）上成像。
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圖8.Calbryte 520或Fluo-4 AM測(cè)量的CHO-M1細(xì)胞中外源M1受體的卡巴膽堿刺激的鈣反應(yīng)。 將CHO-M1細(xì)胞以每100 μL每孔40,000個(gè)細(xì)胞的孔接種在黑色96孔板上。 將100 μL不含丙磺舒的Fluo-4 AM或Calbryte 520 AM加入細(xì)胞中，并將細(xì)胞在37℃下孵育45分鐘。 FlexStation 3（分子設(shè)備）添加了卡巴膽堿（50 μL /孔）以達(dá)到*終指示的濃度。
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圖9. CHO-K細(xì)胞中內(nèi)源性P2Y受體對(duì)ATP的反應(yīng)。 將CHO-K細(xì)胞以每100 μL 40,000個(gè)細(xì)胞的孔接種在黑色96孔板上。 將含有2 mM丙磺舒的HHBS中的100 μL Calbryte 590 AM或Calbryte 630 AM加入孔中，并將細(xì)胞在37°C下孵育1小時(shí)。 將染料加載介質(zhì)替換為200 μL HHBS，用50 μL 50 μM ATP處理，并使用TRITC通道（Calbryte 590）和Texas Red Channel（Calbryte 630）用熒光顯微鏡（Keyence）成像。
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Calbryte 520、Calbryte 590、Calbryte 630相關(guān)產(chǎn)品：
單波長(zhǎng)與比率法的優(yōu)缺點(diǎn)對(duì)比
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單波長(zhǎng)
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比率
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1.在靜息鈣水平下背景熒光*小
2.良好的信噪比
3.大大提高了細(xì)胞內(nèi)保留
4.覆蓋光譜：紫外線（UV），紫色和可見(jiàn)光激發(fā)
5.不同的親和力（低、中、高）提供的敏感度滿足于各種應(yīng)用
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1.準(zhǔn)確測(cè)量細(xì)胞內(nèi)鈣濃度
2.將染料負(fù)載不均勻、染料泄漏、光漂白和細(xì)胞厚度變化（常見(jiàn)于混合群體）的影響降至*低
3.提供更可靠和可重復(fù)的結(jié)果
4.指示劑擁有雙激發(fā)/發(fā)射光線
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