TF/TQ染料標記MMP和酪蛋白的肽序列及結(jié)果
材料和方法
所有肽均采用美國肽公司標準FMOC化學(xué)合成。一些TF肽是用FMOC-Lys（TF）-OH、FMOC-Asp（TF）-OH或FMOC-Glu（TF）-OH氨基酸制備的。在肽的標記中，用TF-NHS酯標記賴氨酸殘基的N端氨基或ε-氨基。用TF馬來酰亞胺或碘代乙酰胺標記巰基半胱氨酸殘基。
TF1，TF2，TF3，TF4，TF5，TF6，TF7和TF8的酸、馬來酰亞胺和NHS酯形式，以及FMOC-Lys（TF2-Boc）-OH，F(xiàn)MOC-Lys（TF3）-OH，F(xiàn)MOC-Asp（TF3）-OH，F(xiàn)MOC-Glu（TF3）-OH等均可從百螢生物獲得。
所有的酶分析都是用從Sigma，R＆D Systems，EMD Chemicals購買的純化酶完成的。使用用日立U-3010拍攝了吸收光譜，終點熒光分析在BMG NovoStar或Gemini SpectraMax（分子設(shè)備）上進行，酶動力學(xué)分析在FlexStation分子設(shè)備上進行）。
Tide Fluor （TF）染料的光譜特性
我們的TF系列熒光標記染料覆蓋了整個可見光譜，具有非常高的標記效率。例如，TF2的光譜特性與AF 488、FAM和FITC基本相同。在生理條件下或細胞內(nèi)，它比熒光素亮3倍，耐光性高4倍。TF染料具有對pH4～pH10的pH波動不敏感的熒光，而FAM和FITC的熒光強度在同一范圍內(nèi)強烈依賴于pH值。
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TF 染料
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Ex(nm)
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Em(nm)
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可替代
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TF1
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353 nm
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442 nm
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AF350, AMCA, EDANS
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TF2
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498 nm
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520 nm
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AF488; DL488, FITC, FAM, Cy2
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TF3
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560 nm
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575 nm
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AF546, AF555, Cy3, DL549, TAMRA
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TF4
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585 nm
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605 nm
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AF594, DL594, Texas Red®, ROX
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TF5
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650 nm
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670 nm
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AF633, AF647, DL633, DL649, Cy5
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TF6
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685 nm
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700 nm
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AF680, DL680, Cy5.5
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TF7
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755 nm
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780 nm
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AF750, DL750, Cy7
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TF8
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785 nm
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800 nm
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DL800, IRDye CW800
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使用TF標記的FRET底物檢測基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）活性
基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）參與細胞外基質(zhì)成分的降解，在細胞凋亡、胚胎發(fā)育、生殖組織重塑和修復(fù)中起重要作用。 百螢為大家篩選了以下基于TF的FRET底物，以檢測MMP活性。
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#Sub
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肽序列
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Ex
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Em
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1
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TQ2-Gaba-Pro-Cha-Abu-Smc-His-AlaDab(5-FAM)-Ala-Lys-NH2
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492 nm
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514 nm
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2
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TQ2-Gaba-Pro-Cha-Abu-Smc-His-AlaDab(TF2)-Ala-Lys-NH2
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495 nm
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520 nm
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3
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TQ3-Gaba-Pro-Cha-Abu-Smc-His-AlaLys(TF3)-Ala-Lys-NH2
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560 nm
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575 nm
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4
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TQ4-Gaba-Pro-Cha-Abu-Smc-His-AlaLys(TF4)-Ala-Lys-NH2
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585 nm
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605 nm
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5
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TQ5-Gaba-Pro-Cha-Abu-Smc-His-AlaLys(FT5)-Ala-Lys-NH2
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650 nm
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670 nm
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6
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TQ6-Gaba-Pro-Cha-Abu-Smc-His-AlaLys(FT6)-Ala-Lys-NH2
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685 nm
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700 nm
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7
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TQ7-Gaba-Pro-Cha-Abu-Smc-His-AlaLys(TF7)-Ala-Lys-NH2
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755 nm
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780 nm
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8
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TQ8-Gaba-Pro-Cha-Abu-Smc-His-AlaLys(TF8)-Ala-Lys-NH2
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785 nm
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800 nm
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MMP活性的檢測（續(xù)）
圖1.以TF為基礎(chǔ)的MMP底物與MMP-1（50units/ml）在室溫下孵育15分鐘。所有基質(zhì)在5 uM的溫度下使用，使用Sub#2的反應(yīng)速度設(shè)定為100%。用上表中分別列出的激發(fā)波長和發(fā)射波長測量熒光強度。
用TF標記酪蛋白底物檢測通用蛋白酶活性
對各種蛋白酶活性的檢測已成為許多生物實驗室的常規(guī)任務(wù)。TF染料標記的酪蛋白綴合物被證明是廣泛的蛋白酶的通用底物。在完整的底物中，酪蛋白被TF染料大量標記，導(dǎo)致了熒光猝滅。蛋白酶催化水解減輕了它的淬滅效應(yīng)，產(chǎn)生熒光性很強的TF染料標記的肽段。TF染料標記肽熒光強度的增加與蛋白酶活性成正比。
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#Sub
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肽底物
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Ex/Em
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相對Kcat/Km
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1
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TF1-Casein (~6 Dyes/Casein)
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492/514 nm
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98%
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2
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TF2-Casein (~6 Dyes/Casein)
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495/520 nm
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92%
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3
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TF3-Casein (~6 Dyes/Casein)
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560/575 nm
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100%
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4
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TF4-Casein (~5 Dyes/Casein)
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585/605 nm
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73%
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5
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TF5-Casein (~5 Dyes/Casein)
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650/670 nm
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81%
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6
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TF6-Casein (~4 Dyes/Casein)
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685/700 nm
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76%
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7
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TF7-Casein (~4 Dyes/Casein)
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755/780 nm
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56%
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8
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TF8-Casein (~4 Dyes/Casein)
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785/800 nm
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43%
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圖2. #3底物胰蛋白酶的蛋白水解裂解圖。 在室溫下將3號底物與胰蛋白酶一起孵育。對照孔僅具有蛋白酶底物，而沒有胰蛋白酶。 使用FlexStation從時間0（添加胰蛋白酶時）開始檢測熒光信號。
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