基本信息
貨號(hào)：15276（assays）
儲(chǔ)存條件：保存在冰箱并避光
適用儀器：酶標(biāo)儀
簡(jiǎn)介
煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP +）是在細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的兩種重要的輔因子。 NADH是NAD +的還原形式。 NAD形成NADP，通過(guò)酯鍵將磷酸基團(tuán)添加到腺苷核苷酸的2'位置。傳統(tǒng)的NAD / NADH和NADP / NADPH測(cè)定基于監(jiān)測(cè)340nm處NADH或NADPH吸收的變化。 NAD / NADH和NADP / NADPH的短紫外波長(zhǎng)
分析使傳統(tǒng)方法具有低靈敏度和高干擾。 AAT Bioquest的Amplite?比色總NADP / NADPH檢測(cè)試劑盒為檢測(cè)總NADP和NADPH提供了一種便捷的方法。系統(tǒng)中的酶特異性識(shí)別酶循環(huán)反應(yīng)中的NADP / NADPH。無(wú)需從樣品混合物中純化NADP / NADPH。酶循環(huán)反應(yīng)顯著提高了檢測(cè)靈敏度。 NADPH探針是一種生色傳感器，在NADP減少時(shí)具有460nm的吸光度。 NADPH探針的吸收與溶液中NADPH的濃度成正比。 Amplite?比色總NADP和NADPH分析試劑盒提供靈敏的分析，可在100μL分析體積中檢測(cè)低至0.03μM的總NADP / NADPH。與套件＃15260相比，該套件具有更高的靈敏度。
試劑盒組成
96孔板測(cè)定方案
簡(jiǎn)要總結(jié)
準(zhǔn)備NADP / NADPH反應(yīng)混合物（50μL）®
添加NADPH標(biāo)準(zhǔn)品或測(cè)試樣品（50μL）®
在室溫下孵育15分鐘至2小時(shí)®®
監(jiān)測(cè)460 nm處的吸光度
注意：在開始實(shí)驗(yàn)之前，在室溫下解凍每個(gè)試劑盒組分中的一個(gè)
步驟
1.準(zhǔn)備NADPH原液：
將200μLPBS緩沖液加入到NADPH標(biāo)準(zhǔn)品（組分C）的小瓶中以制備1mM（1nmol /μL）NADPH儲(chǔ)備溶液。
注意：未使用的NADPH原液應(yīng)分成單次使用的等分試樣并儲(chǔ)存在-20 oC。
2.制備NADP / NADPH反應(yīng)混合物：
2.1將8 mL NADPH探針緩沖液（組分B-II）加入到NADP / NADPH回收酶混合物（組分A）的瓶中，并充分混合。
2.2將2 mL NADPH探針（組分B-I）加入上述瓶中（來(lái)自步驟2.1）并充分混合。
注意：這種NADP / NADPH反應(yīng)混合物足以進(jìn)行200次分析。 未使用的NADP / NADPH反應(yīng)混合物應(yīng)分成一次性等分試樣并儲(chǔ)存在-20℃。
3.準(zhǔn)備NADPH標(biāo)準(zhǔn)品的連續(xù)稀釋液（0至2μM）：
3.1將2μL的1mM NADPH儲(chǔ)備液（來(lái)自步驟1）加入998μLPBS緩沖液（pH 7.4）中，得到2μM（2 pmols / L）NADPH標(biāo)準(zhǔn)溶液。
注意：稀釋的NADPH標(biāo)準(zhǔn)溶液不穩(wěn)定，應(yīng)在4小時(shí)內(nèi)使用。
3.2取200μL的2μMNADPH標(biāo)準(zhǔn)溶液（來(lái)自步驟3.1）進(jìn)行1：2連續(xù)稀釋，得到1，0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0313和0mM系列稀釋的NADPH標(biāo)準(zhǔn)品。
3.3如表1和2中所述，將NADPH標(biāo)準(zhǔn)品和含有NADP / NADPH的測(cè)試樣品的系列稀釋液加入白色/透明底96孔微量培養(yǎng)板中。
注意：根據(jù)需要準(zhǔn)備細(xì)胞或組織樣本。 為方便起見，裂解緩沖液（組分D）可用于裂解細(xì)胞。 （詳見附錄）。
表1：白色/透明底96孔微孔板中NADPH標(biāo)準(zhǔn)品和測(cè)試樣品的布局
注意：NS = NADPH標(biāo)準(zhǔn)，BL =空白對(duì)照，TS =測(cè)試樣品。
表2：每個(gè)孔的試劑組成
*注意：將連續(xù)稀釋的NADPH標(biāo)準(zhǔn)品（0.0313μM至2μM）加入NS1至NS7的孔中，一式兩份。 高濃度的NADPH（例如，>30μM，濃度）將導(dǎo)致飽和信號(hào)并使校準(zhǔn)曲線非線性。
4.在上清液反應(yīng)中運(yùn)行NADPH測(cè)定：
4.1將50μL的NADP / NADPH反應(yīng)混合物（來(lái)自步驟2.2）加入NADPH標(biāo)準(zhǔn)品，空白對(duì)照和測(cè)試樣品的每個(gè)孔中（參見步驟3.3），使總NADP / NADPH測(cè)定體積為100μL/孔
注1：對(duì)于384孔板，每孔加入25μL樣品和25μLNAP/ NADPH反應(yīng)混合物。
注2：根據(jù)需要準(zhǔn)備細(xì)胞或組織樣本。 為方便起見，裂解緩沖液（組分D）可用于裂解細(xì)胞。 （詳見附錄）。
4.2在室溫下孵育反應(yīng)15分鐘至2小時(shí)，避光。
4.3使用吸光度讀板儀在460 nm處監(jiān)測(cè)吸光度的增加。
數(shù)據(jù)分析
空白孔中的吸光度（僅用PBS緩沖液）用作對(duì)照，并從具有NADPH反應(yīng)的那些孔的值中減去。 NADPH標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。
圖1。 使用SpectraMax酶標(biāo)儀（Molecular devices），在96孔白色/透明底板中用Amplite TM比色總NADP和NADPH測(cè)定試劑盒*增強(qiáng)靈敏度*測(cè)量NADPH劑量反應(yīng)。 孵育1小時(shí)（n = 3）可以檢測(cè)到低至0.03μM的NADPH，在460nm處測(cè)量吸光度。
附錄：使用組分D（裂解緩沖液）的測(cè)試樣品制劑
1.植物細(xì)胞樣品：用200mg / mL的裂解緩沖液均質(zhì)化，并以2500rpm離心5-10分鐘，使用上清液進(jìn)行測(cè)試。
2.**細(xì)胞樣品：離心收集**細(xì)胞（（10,000 g，0°C，15 min）。使用約1億至1千萬(wàn)細(xì)胞/ mL裂解緩沖液，將處理后的溶液在室溫下保持15分鐘.2500℃離心 轉(zhuǎn)速5分鐘，用上清液進(jìn)行試驗(yàn)。
3.哺乳動(dòng)物細(xì)胞樣品：從平板孔中取出培養(yǎng)基，每1-5百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞使用約100μL裂解緩沖液（或在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中使用50-100μL/孔），并將處理過(guò)的溶液保持在室溫下 15分鐘。 直接使用細(xì)胞裂解液或以1500 rpm離心5分鐘，使用上清液進(jìn)行測(cè)試。
4.組織樣品：稱取約20mg組織，用冷PBS洗滌。 在微量離心管中用400μl裂解緩沖液均化。 以2500rpm離心5-10分鐘，使用上清液進(jìn)行測(cè)定。
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