簡介
鈣通量測定是用于篩選G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）的**發(fā)現(xiàn)中的優(yōu)選方法。 我們的Fluo-8®和Rhod-4?系列鈣檢測試劑是極亮的綠色和紅色鈣指示劑，而我們的Cal-520®和Cal-590?具有極高的細胞內(nèi)鈣檢測信號/背景比，因為它們在 活細胞。 AAT Bioquest提供其他鈣指標，如Fluo-4，Fluo-3，Fura-2，Indo-1，Rhod-5N和Rhod-2 AM，質(zhì)量極高。
表1.鈣檢測試劑的光譜和Ca2 +結(jié)合特性
* Cal Green?1與Calcium Green-1的分子相同
表2.葡聚糖，生物素或生物胞素綴合的熒光鈣指示劑
儲存條件
儲存于-20°C，避光。 到期日為自收到之日起12個月。
使用鈣指示劑AM酯類
1.使用鈣指示劑AM Esters加載細胞：
AM酯是非極性酯，其易于穿過活細胞膜，并且通過活細胞內(nèi)的細胞酯酶快速水解。 AM酯廣泛用于非侵入性地將各種極性熒光探針裝載到活細胞中。 但是，使用AM酯時必須小心謹慎，因為它們易于使用水解，特別是在溶液中。 它們應該用高質(zhì)量的無水二甲基亞砜（DMSO）重新配制。 DMSO儲備溶液應在-20°C下干燥保存并避光。 在這些條件下，AM酯應穩(wěn)定數(shù)月。
以下是我們推薦的將AM酯加載到活細胞中的方案。 該協(xié)議僅提供指南，應根據(jù)您的特定需求進行修改。
a）在高質(zhì)量無水DMSO中制備2至5mM AM酯原液。
b）在實驗當天，將鈣指示劑溶解在DMSO中固體或?qū)⒌确莸闹甘緞﹥淙芤航鈨鲋潦覝亍?使用0.04％Pluronic®F-127在您選擇的緩沖液（如Hanks和Hepes緩沖液）中制備2至20μM的工作溶液。 對于大多數(shù)細胞系，我們建議鈣指示劑的濃度為4-5μM。 指標的確切濃度細胞加載所需的必須根據(jù)經(jīng)驗確定。 為避免因過載和潛在染料毒性引起的任何偽影，建議使用能夠產(chǎn)生足夠信號強度的極小探針濃度。
注意：非離子型洗滌劑Pluronic®F-127有時用于增加鈣指示劑AM酯的水溶性。 各種Pluronic®F-127解決方案可從AAT Bioquest購買。
c）如果您的細胞（如CHO細胞）含有有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白，丙磺舒（2-5 mM）或磺吡酮（0.2-0.5 mM）可能會添加到染料工作溶液中（濃度為1） 對丙磺舒為-2.5 mM，對于磺胺吡喃酮為0.1-0.25 mM）以減少去酯化指示劑的泄漏。
注意：各種ReadiUse?丙磺舒（包括水溶性鈉鹽和穩(wěn)定溶液）均可從AAT Bioquest購買
d）將等體積的染料工作溶液（來自步驟b或c）加入細胞板中。
e）將染料加載板室在溫度或37℃下孵育20分鐘（尤其是Fluo-8AM）至2小時，然后將板在室溫下再孵育30分鐘。
注1：降低加載溫度可能會減少指示符的劃分。
注2：孵育Cal-520 AM超過2小時可以為某些細胞系提供更好的信號強度
f）用HHBS或您選擇的緩沖液（含有陰離子轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑，如1mM丙磺舒，如果適用）替換染料工作溶液，以去除多余的探針。
g）在所需的Ex / Em波長下進行實驗（見表1）。
2.測量細胞內(nèi)鈣響應：
圖1.沒有丙磺舒的CHO-M1細胞中內(nèi)源性P2Y受體對ATP的反應。將CHO-M1細胞在96孔黑壁/透明底板中以每100μL/孔40,000個細胞接種過夜。將100μl4μMFluo-3AM，Fluo-4AM或Cal 520 [表達] AM在HHBS中加入孔中，并將細胞在37℃下孵育2小時。用100μlHHBS替換染料加載培養(yǎng)基，加入50μl300μMATP，然后使用FITC通道用熒光顯微鏡（Olympus IX71）成像。
圖2.用Cal520或Fluo-4AM測量的CHO-K1細胞中ATP刺激的內(nèi)源性P2Y受體的鈣響應。 在96孔黑壁/透明底板中，將CHO-K1細胞以每100μL/孔50,000個細胞接種過夜。 向細胞中加入100μL5μMFluo-4AM或具有（A）或不含（B）2.5mM丙磺舒的Cal-520 AM，并將細胞在37℃下溫育2小時。 通過FlexStation（Molecular Devices）添加ATP（50μL/孔）以達到指示的濃度。
使用鈣指示劑鹽
為了確定溶液的游離鈣濃度或單波長鈣指示劑的Kd，使用以下等式：
[Ca]自由= Kd [F - Fmin] / Fmax - F]
其中F是指示劑在實驗鈣水平下的熒光，Fmin是不存在鈣時的熒光，Fmax是鈣飽和探針的熒光。 解離常數(shù)（Kd）是探針對鈣的親和力的量度。與校準溶液相比，熒光指示劑的Ca 2+結(jié)合和光譜性質(zhì)在細胞環(huán)境中變化非常顯著。細胞內(nèi)指標的原位校準通常產(chǎn)生顯著高于體外測定的Kd值。 通過在離子載體如A-23187,4-溴A-23187和離子霉素存在下將加載的細胞暴露于受控的Ca 2+緩沖液來進行原位校準。 或者，細胞透化劑如洋地黃皂苷或X-100可用于將指示劑暴露于細胞外培養(yǎng)基的受控Ca2 +水平。 表1列出了一些鈣試劑的Kd值供您參考。
使用鈣指示劑結(jié)合物
與游離離子指示劑相比，這些相同指示劑的葡聚糖綴合物表現(xiàn)出減少的區(qū)室化和低得多的染料滲漏率。由于葡聚糖的分子量，凈電荷，標記程度和染料性質(zhì)可能影響實驗，建議研究人員咨詢初級有關應用興趣的信息的文獻。
參考文獻
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