百螢-Cy3 酪胺產(chǎn)品實(shí)驗(yàn)方案詳情

Cy7酪胺是美國(guó)AAT Bioquest生產(chǎn)的Cy系列產(chǎn)品，對(duì)于許多免yi組織化學(xué)（IHC）應(yīng)用，傳統(tǒng)的酶促擴(kuò)增程序足以實(shí)現(xiàn)足夠的抗原檢測(cè)。但是，有幾個(gè)因素限制了這些程序的敏感性和實(shí)用性。百螢生物是AAT Bioquest的中國(guó)代理商，為您提供的Cy7酪胺。

適用儀器

實(shí)驗(yàn)方案

樣品染色示例

概述

1.固定/透化/阻斷細(xì)胞或組織
2.在封閉緩沖液中加入一抗
3.加入HRP偶聯(lián)的二抗
4.準(zhǔn)備酪胺工作溶液，在室溫下在細(xì)胞或組織中施用5-10分鐘

操作步驟

  在沒(méi)有額外說(shuō)明的情況下，所有未使用的儲(chǔ)備溶液應(yīng)分成一次性等分試樣，并在制備后儲(chǔ)存在-20°C，避免反復(fù)凍融循環(huán)。該方案適用于細(xì)胞和組織染色。

1.制備儲(chǔ)存溶液

Tyramide原液（1000X）加入適量的DMSO，制成1-5mM的酪胺儲(chǔ)備液。

注意：未使用的Tyramide原液可以在2-8℃下儲(chǔ)存

2.制備工作溶液

Tyramide工作溶液（1X）：
將1μLTyramide原液加入1 mL含有0.003％H2O2的緩沖液中。
注意：Tris Buffer，pH = 7.4時(shí)可用于獲得佳性能。
注意：Tyramide工作溶液應(yīng)立即使用。

3. 細(xì)胞固定和透化

4. 3.1在室溫下用PBS中的3.7％甲醛或多聚甲醛固定細(xì)胞或組織20分鐘。
3.2用PBS沖洗細(xì)胞或組織兩次。
3.3在室溫下用0.1％Triton X-100溶液使細(xì)胞透化1-5分鐘。
3.4用PBS沖洗細(xì)胞或組織兩次。
注意：組織固定，脫蠟和再水化，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)IHC方案對(duì)組織進(jìn)行脫蠟和脫水。根據(jù)需要使用優(yōu)選的特定溶液/方案進(jìn)行抗原修復(fù)。

4.過(guò)氧化物酶標(biāo)記

4.1任選：通過(guò)在過(guò)氧化物酶猝滅溶液（例如3％過(guò)氧化氫）中孵育細(xì)胞或組織樣品10分鐘來(lái)淬滅內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，在室溫下用PBS沖洗兩次。 
4.2可選：如果使用HRP偶聯(lián)的鏈霉抗生物素蛋白，建議通過(guò)生物素阻斷緩沖液阻斷內(nèi)源性生物素。
4.3用優(yōu)選的封閉溶液（例如含有1％BSA的PBS）在4℃下封閉30分鐘。

4.4取出封閉溶液，加入在推薦抗體稀釋液中稀釋的一抗在室溫下60分鐘或在4°C下過(guò)夜。
4.5用PBS洗滌三次，每次5分鐘。
4.6向每個(gè)樣品中加入100μL二抗-HRP工作溶液，在室溫下孵育60分鐘。
注意孵育時(shí)間和濃度可根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度而變化。
4.7用PBS洗滌三次，每次5分鐘。

5.酪胺標(biāo)記

5.1為每個(gè)樣品準(zhǔn)備并應(yīng)用100μL酪胺工作溶液，并在室溫下孵育5-10分鐘。
注意：如果您觀(guān)察到非特異性信號(hào)，可以縮短酪胺的孵育時(shí)間。您應(yīng)該在不同的孵育時(shí)間點(diǎn)使用陽(yáng)性和陰性對(duì)照樣品優(yōu)化孵育期?；蛘吣梢栽诠ぷ魅芤褐惺褂幂^低濃度的酪胺。

5.2用PBS沖洗三次。

6.熒光成像

1.根據(jù)需要對(duì)細(xì)胞或組織樣本進(jìn)行計(jì)數(shù)。AAT提供了一系列細(xì)胞核復(fù)染試劑，如表1所列。按照試劑提供的說(shuō)明進(jìn)行操作。
2.使用具有抗褪色特性的安裝介質(zhì)安裝蓋玻片。
3.使用適當(dāng)?shù)倪^(guò)濾器組可視化來(lái)自酪胺標(biāo)簽的信號(hào)。

表1.推薦用于核復(fù)染的產(chǎn)品