酶聯(lián)免yi吸附試驗(yàn)（簡(jiǎn)稱ELISA）概述
ELISA是一種基于平板的免yi測(cè)定法，用于檢測(cè)和定量生物分子如抗體、蛋白質(zhì)、激su或肽，以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-核酸相互作用的角色塑造。在ELISA中，感興趣的靶標(biāo)(通常是抗原)被固定在固體表面上，然后用與酶(如辣根過氧化物酶蛋白(HRP)或堿性磷酸酶蛋白(AP))結(jié)合的抗體進(jìn)行探測(cè)。定量是通過與底物孵育實(shí)現(xiàn)的，底物是由酶催化的，產(chǎn)生可測(cè)量的副產(chǎn)品。酶聯(lián)免yi吸附法一般分為三類:直接ELISA、間接ELISA和三明治ELISA。
一.直接ELISA
在直接ELISA中,抗原通過被動(dòng)吸附直接固定在平板表面,并用HRP標(biāo)記的原抗體檢測(cè)。將無色底物引入樣品,樣品與酶結(jié)合物反應(yīng),產(chǎn)生可測(cè)量的副產(chǎn)物。根據(jù)襯底的選擇,這種副產(chǎn)品可以是比色的,化學(xué)發(fā)光的或熒光的。信號(hào)產(chǎn)生的數(shù)量與樣品中抗原的數(shù)量成正比。在所有的酶聯(lián)免yi吸附測(cè)定格式中,直接酶聯(lián)免yi吸附測(cè)定是簡(jiǎn)單和快的,然而,它們是不敏感的。
比色直接ELISA
實(shí)驗(yàn)方法：
1. 用檢測(cè)抗原、密封板和在4攝氏度下一夜培養(yǎng)的酶聯(lián)免yi吸附試驗(yàn)板
2. 用所需緩沖劑拆下涂層溶液和清洗板2次
3. 在4攝氏度時(shí),用所需封塊溶液進(jìn)行1小時(shí)的封塊板
4. 用緩沖器洗盤子3次
5. 在室溫下用HRP標(biāo)記的原抗體注射1小時(shí)
6. 用緩沖器洗盤子4次
7. 帶重復(fù)使用的長(zhǎng)襯底溶液的嵌入板(CAT編號(hào)) 11012 在室溫下持續(xù)15-30分鐘。
8. 用酶聯(lián)免yi吸附儀微平板探測(cè)器測(cè)量650納米的吸收信號(hào)
二.間接ELISA
間接ELISA實(shí)質(zhì)上是直接ELISA的修正版。在間接酶聯(lián)免yi吸附法中,用于檢測(cè)抗原的主要抗體是不結(jié)合的。取而代之的是一種酶標(biāo)記的次級(jí)抗體,它對(duì)主抗體的寄種具有反應(yīng)性,用于檢測(cè)主抗原復(fù)合物(間接檢測(cè)抗原)。將無色底物引入樣品中,樣品與酶結(jié)合物反應(yīng),產(chǎn)生可測(cè)量的副產(chǎn)物。根據(jù)底物的選擇,這種副產(chǎn)物可以是比色的,化學(xué)發(fā)光的或熒光的。信號(hào)產(chǎn)生的數(shù)量與樣品中抗原的數(shù)量成正比。二次檢測(cè)試劑的使用優(yōu)于直接酶聯(lián)免yi吸附測(cè)定(即信號(hào)放大)。
比色法間接ELISA
試驗(yàn)方法：
1.用檢測(cè)抗原、密封板和在4攝氏度下一夜培養(yǎng)的酶聯(lián)免yi吸附試驗(yàn)板
2.用所需緩沖劑拆下涂層溶液和清洗板2次
3.在4攝氏度時(shí),用所需封塊溶液進(jìn)行1小時(shí)的封塊板
4.用緩沖器洗盤子2次
5.常溫下未結(jié)合初級(jí)抗體植入1小時(shí)
6.用緩沖器洗盤子4次
7.用HRP標(biāo)記的二次抗體在室溫下植入1小時(shí)(阻斷緩沖)
8.用緩沖器洗盤子4次
9.帶重復(fù)使用的長(zhǎng)襯底溶液的嵌入板(CAT編號(hào)) 11012 在室溫下持續(xù)15-30分鐘。
10.用酶聯(lián)免yi吸附儀微平板探測(cè)器測(cè)量650納米的吸收信號(hào)
三．三明治ELISA
它要求使用匹配的抗體,每個(gè)抗體是針對(duì)不同的無重疊抗原表位。其中一種抗體,稱為捕捉抗體,首先被涂在一個(gè)多井微滴板的表面,以促進(jìn)固定目標(biāo)抗原。然后di二種抗體,稱為檢測(cè)抗體,結(jié)合到捕捉抗體-抗原復(fù)合物(因此術(shù)語"三明治",因?yàn)榭乖墙Y(jié)合在匹配的抗體對(duì)之間)。添加了檢測(cè)抗體(而不是捕捉抗體)的酶標(biāo)記次級(jí)抗體結(jié)合物。一旦二次結(jié)合到檢測(cè)抗體,酶標(biāo)記次級(jí)抗體催化反應(yīng)與其各自的底物產(chǎn)生可測(cè)量的信號(hào)。
比色三明治ELISA
試驗(yàn)方法：
1. 含有捕捉抗體、密封板和4攝氏度夜間孵化的pcv微滴板覆蓋井
2. 用所需緩沖劑拆下涂層溶液和清洗板2次
3. 在4攝氏度時(shí),用所需封塊溶液進(jìn)行1小時(shí)的封塊板
4. 用所需的緩沖器洗盤子2次
5. 在每一口井中添加樣品,在37℃條件下孵化2小時(shí)
6. 用所需的緩沖劑將樣品和清洗板拆下2次
7. 常溫下注射1小時(shí)非結(jié)合檢測(cè)抗體
8. 用所需的緩沖器洗盤子4次
9. 用HRP標(biāo)記的二次抗體在室溫下植入1小時(shí)(阻斷緩沖)
10. 用所需的緩沖器洗盤子4次
11. 帶重復(fù)使用的長(zhǎng)襯底溶液的嵌入板(CAT編號(hào)) 11012 在室溫下持續(xù)15-30分鐘。
12. 用酶聯(lián)免yi吸附儀微平板探測(cè)器測(cè)量650納米的吸收信號(hào)