百螢課堂之細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)測(cè)定（下篇）

三、細(xì)胞增殖的染色稀釋實(shí)驗(yàn)

CFSE和Cyto Tell^TM指示劑是流式細(xì)胞術(shù)用于檢測(cè)活細(xì)胞增殖的熒光追蹤染料。當(dāng)細(xì)胞分列時(shí)，熒光染料在自細(xì)胞之間均與分布，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度隨每一代的發(fā)展而減半。這些增值染料可以長(zhǎng)期用于追蹤細(xì)胞增殖。

 

應(yīng)用CFSE進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測(cè)

CFSE（#22022）和RediUse是細(xì)胞滲透型綠色熒光增殖指示劑，當(dāng)被488nm氬離子激光激發(fā)時(shí)，在517nm出發(fā)出熒光信號(hào)。兩種染料被動(dòng)的擴(kuò)散并穿過(guò)未受損的細(xì)胞膜，由此與細(xì)胞內(nèi)脂酶的酶反應(yīng)從CFSE切割乙酸基以產(chǎn)生與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合的胺反應(yīng)性羧基熒光素SE。雖然CFSE仍然被廣泛用作在498nm激發(fā)下的綠色熒光增殖指示劑，但它絕非無(wú)條件。CFSE對(duì)細(xì)胞具有局毒性，容易發(fā)生染料泄露，并且會(huì)溢出到PE和PE-Texas紅通道中。

 

細(xì)胞增殖指標(biāo)

        Cyto Tell^TM 染料是一系列細(xì)胞滲透型熒光示蹤劑，旨在監(jiān)測(cè)活細(xì)胞的細(xì)胞增殖，而不存在任何缺點(diǎn)的CFSE。細(xì)胞膜被動(dòng)擴(kuò)散后，CytoTell^TM 染料被細(xì)胞內(nèi)酯酶水解以產(chǎn)生高度熒光的胺反應(yīng)性或硫醇反應(yīng)性染料，其不可逆地與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)上的胺或硫醇基團(tuán)結(jié)合。細(xì)胞毒性很小，經(jīng)過(guò)幾代的分裂，染料在細(xì)胞內(nèi)保留得很好。使用 CytoTell^TM UltraGreen (22240)可視化多達(dá)9代。CytoTell^TM 染料有7種不同的熒光發(fā)射 顏色，在多色分析中提供更大的靈活性。他們可以固定和滲透，以分析細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)使用標(biāo)準(zhǔn)甲醛含固定劑和皂甙為基礎(chǔ)的滲透緩沖液。

圖1.CytoTell^TMGreen和CFSE檢測(cè)細(xì)胞增殖。在第0天將 Jurkat 細(xì)胞(- 2x106個(gè)細(xì)胞/mL)用 CytoTell^TM Green 或 CFSE 染色。然后在指定的日期以1:1的比例連續(xù)傳遞細(xì)胞。用 ACEA NovoCyte 3000流式細(xì)胞儀測(cè)定通過(guò)當(dāng)天 FITC 通道的熒光強(qiáng)度。不同的顏色峰代表連續(xù)幾代。

表1.用于流式細(xì)胞儀的 CytoTell^TM 和 CFSE 細(xì)胞增殖染料

四．細(xì)胞增殖分析

       ATP 存在于所有代謝活躍的細(xì)胞中，在死細(xì)胞中幾乎不存在，是鑒定活細(xì)胞的合適的生物標(biāo)志物。ATP 的定量分析已被用于確定哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性，并用于檢測(cè)水、土壤和血液等樣品中的低水平污染。雖然可以使用多種檢測(cè)方法，但由于其較高的靈敏度，研究人員通常選擇基于熒光素-熒光素酶生物發(fā)光的 ATP 分析來(lái)測(cè)量細(xì)胞增殖。PhosphoWorksTM發(fā)光 ATP 測(cè)定試劑盒提供了一種簡(jiǎn)單和均勻的方法來(lái)測(cè)量 ATP 使用螢火蟲(chóng)螢光素酶及其底物螢光素。在 Mg2 + 存在下，螢火蟲(chóng)螢光素酶催化螢光素、 ATP 和 O2的反應(yīng)，產(chǎn)生約560nm 的光，可以用光度計(jì)檢測(cè)到。存在的 ATP 濃度與樣品中活細(xì)胞的數(shù)量成正比。也可以使用 PhosphoWorksTM 比色 ATP 測(cè)定試劑盒(21617)和 PhosphoWorksTM 熒光 ATP 測(cè)定試劑盒(21620) ，其可以分別在100μL 反應(yīng)體積中檢測(cè)約3μM 或約0.4 μM 的 ATP。

圖2.使用 NOVOstar 讀板器(BMG Labtech)在96孔板上使用 PhosphoWorks^TM 發(fā)光 ATP 測(cè)定試劑盒 * DTT-Free * 測(cè)量 Jurkat 細(xì)胞。這個(gè)試劑盒可以檢測(cè)到低至100個(gè)細(xì)胞。積分時(shí)間為1秒。

表2.測(cè)定細(xì)胞增殖的ATP實(shí)驗(yàn)