細(xì)胞凋亡之所以成為人們研究的一個(gè)熱點(diǎn)，在很大程度上決定于細(xì)胞凋亡與臨床病毒的密切關(guān)系。這種關(guān)系不僅表現(xiàn)在凋亡及其機(jī)制的研究，闡明了一大類**病的發(fā)病機(jī)制，而且由此可以導(dǎo)致**新療法的出現(xiàn)。Caspase家族在細(xì)胞凋亡中起著至關(guān)重要的作用，今天百螢帶你來了解一下Caspase家族與細(xì)胞凋亡千絲萬縷的聯(lián)系。
Caspase：
概念：Caspases是近年來發(fā)現(xiàn)的一組存在于胞質(zhì)溶膠中的結(jié)構(gòu)上相關(guān)的半胱氨酸蛋白酶，它們的一個(gè)重要共同點(diǎn)是活性位點(diǎn)都含有半胱氨酸，并特異地?cái)嚅_天冬氨酸殘基后的肽鍵。Caspase一詞是從Cysteine aspartic acid specific protease 的字頭縮寫衍生而來，就反映了這個(gè)特征，而這種高度的特異性，在蛋白酶中是很少見的。
機(jī)制：半胱天冬酶是細(xì)胞質(zhì)天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶，其作為細(xì)胞凋亡的主要介質(zhì)。它們的活化受Bcl-2和IAP蛋白家族成員的調(diào)節(jié)。在接收外部或內(nèi)在死亡信號(hào)后刺激活化，這導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)銜接子分子聚集在受體相關(guān)細(xì)胞溶質(zhì)復(fù)合物上的procaspase。procaspase的聚集通過二聚化或二聚化然后自身蛋白水解切割啟動(dòng)胱天蛋白酶活化。*初的半胱天冬酶活化導(dǎo)致額外的半胱天冬酶蛋白水解直觀地?cái)U(kuò)增半胱天冬酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)。
細(xì)胞凋亡啟動(dòng)子半胱天冬酶及其各自的分析
根據(jù)它們?cè)诎腚滋於讣?jí)聯(lián)反應(yīng)中的作用，半胱天冬酶進(jìn)一步細(xì)分為凋亡啟動(dòng)子半胱天冬酶和凋亡效應(yīng)半胱天冬酶。凋亡啟動(dòng)子半胱天冬酶如胱天蛋白酶-2，-8，-9和-10可以啟動(dòng)半胱天冬酶激活級(jí)聯(lián)反應(yīng)。例如，胱天蛋白酶-8對(duì)于誘導(dǎo)死亡的信號(hào)傳導(dǎo)復(fù)合物（DISC）的形成是必需的，并且當(dāng)激活時(shí)，半胱天冬酶-8激活下游效應(yīng)子半胱天冬酶。已證明胱天蛋白酶-8對(duì)IETD肽序列顯示出相對(duì)高的底物選擇性。百螢生物利用這種酶 - 底物相互作用開發(fā)出有效且穩(wěn)定的試劑盒，用于檢測(cè)caspase-8活性。
百螢生物提供三種選擇的Cell Meter?Caspase 8活性細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，可與不同的過濾器兼容。每個(gè)試劑盒含有獨(dú)特的熒光指示劑，其由與底物選擇性IETD肽序列綴合的特定熒光發(fā)色團(tuán)AMC，R110或ProRed TM組成。該測(cè)定可以容易地優(yōu)化用于高通量篩選并且量化凋亡細(xì)胞中活化的胱天蛋白酶-8的活性或篩選半胱天冬酶8抑制劑。
細(xì)胞凋亡效應(yīng)Caspase及其各自的檢測(cè)
細(xì)胞凋亡效應(yīng)caspase如caspase-3，-6和-7可能不是啟動(dòng)級(jí)聯(lián)途徑的原因，但是當(dāng)它們被激活時(shí)，它們?cè)诩?jí)聯(lián)的中間和后續(xù)步驟中起著不可或缺的作用。例如，caspase-3是一種關(guān)鍵的效應(yīng)因子，因?yàn)樗梢苑糯髞碜詥?dòng)子半胱天冬酶的信號(hào)，并且表示完全致力于細(xì)胞分解。使用DEVD肽序列進(jìn)行活化的胱天蛋白酶-3的檢測(cè)，所述DEVD肽序列對(duì)胱天蛋白酶-3具有選擇性，并證明在開發(fā)胱天蛋白酶-3底物方面是成功的。百螢生物提供兩套獨(dú)特的試劑盒，用于檢測(cè)caspase-3/7活性：Amplite?熒光Caspase 3/7檢測(cè)試劑盒和Cell Meter?Caspase 3/7活性細(xì)胞凋亡試劑盒。
Amplite?熒光Caspase 3/7檢測(cè)試劑盒有三種選擇。每個(gè)試劑盒都含有一個(gè)用熒光發(fā)色團(tuán)AMC，R110或ProRed?修飾的caspase-3選擇性DEVD肽序列，每個(gè)序列都有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)?；赯-DEVD-R110的半胱天冬酶底物由于其兩步裂解過程而表現(xiàn)出較窄的動(dòng)態(tài)范圍。它們比基于香豆素的半胱天冬酶底物更敏感，推薦用于終點(diǎn)分析。基于AMC和AFC的半胱天冬酶底物*適合動(dòng)力學(xué)測(cè)定。雖然我們的ProRed?-DEVD基板具有更長(zhǎng)的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)，因此它們對(duì)于篩選caspase3 / 7抑制劑非常有用。
Cell Meter?Caspase 3/7活性細(xì)胞凋亡試劑盒也有三種選擇，每種都有熒光指示劑底物，用不同的熒光發(fā)色團(tuán)修飾。這些試劑盒旨在通過測(cè)量caspase-3活化來監(jiān)測(cè)細(xì)胞凋亡。它們耐用性很高、適用范圍很廣，可以很容易地適用于各種熒光平臺(tái)（如微孔板分析）中的高通量測(cè)定。
信號(hào)通路用于細(xì)胞凋亡
細(xì)胞凋亡傳統(tǒng)上被認(rèn)為是不可逆的過程，因此細(xì)胞凋亡的起始必須通過特定的激活機(jī)制嚴(yán)格調(diào)節(jié)。兩種*廣泛研究和理解的細(xì)胞凋亡激活機(jī)制是外在和內(nèi)在途徑。百螢生物的caspase檢測(cè)試劑盒已經(jīng)過優(yōu)化，可檢測(cè)和分析半胱天冬酶的活化，因?yàn)樗鼈儗⒌蛲鲂盘?hào)傳遞到外源或內(nèi)源途徑。
外在途徑：
負(fù)責(zé)啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的外源凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑使用腫瘤壞死因子（TNF）受體與其相應(yīng)配體或死亡受體之間的跨膜受體介導(dǎo)的相互作用。TNF受體由富含半胱氨酸的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和80個(gè)氨基酸的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成。死亡受體及其相應(yīng)配體的二聚化激活受體復(fù)合物以開始凋亡信號(hào)的透射。在二聚化時(shí)，銜接蛋白如FADD的募集引發(fā)胱天蛋白酶原-8募集至死亡誘導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物。procaspase-8寡核苷酸化至死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物導(dǎo)致蛋白水解切割和胱天蛋白酶-8活化。（對(duì)于外在途徑機(jī)制，請(qǐng)參考下面的圖1）
圖1.顯示外在和內(nèi)在的凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑
半胱天冬酶結(jié)合測(cè)定在檢測(cè)負(fù)責(zé)啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的外在信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵事件方面是極好的，例如啟動(dòng)子和效應(yīng)子半胱天冬酶的活化。百螢生物提供**的Cell Meter?活細(xì)胞半胱天冬酶結(jié)合試劑盒系列，使用熒光細(xì)胞滲透和無毒指示劑檢測(cè)caspase-1，-2，-3 / 7，-6，-8，-9，-10和13活動(dòng)。在與其適當(dāng)?shù)陌腚滋於附Y(jié)合后，熒光試劑保留在細(xì)胞內(nèi)。該結(jié)合事件阻止半胱天冬酶的任何進(jìn)一步催化而不停止細(xì)胞凋亡過程。這些半胱天冬酶結(jié)合試劑盒適用于熒光顯微鏡，流式細(xì)胞儀和熒光微板讀數(shù)器。半胱天冬酶測(cè)定可以與其他細(xì)胞凋亡測(cè)定結(jié)合進(jìn)行，以闡明外在和內(nèi)在凋亡途徑之間的任何關(guān)系。例如，使用半胱天冬酶結(jié)合測(cè)定結(jié)合檢測(cè)線粒體膜電位變化的測(cè)定法可以揭示外在和內(nèi)在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑之間的任何潛在的“串?dāng)_”。
內(nèi)在途徑：
內(nèi)源性凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑由線粒體信號(hào)傳導(dǎo)蛋白介導(dǎo)。它的功能是響應(yīng)各種類型的細(xì)胞內(nèi)刺激，如DNA損傷，生長(zhǎng)因子戒斷和死亡受體刺激。接收細(xì)胞內(nèi)刺激激活促凋亡蛋白，例如BH3相互作用結(jié)構(gòu)域死亡激動(dòng)劑或BID。Bcl-2家族的其他成員，如Bax，與BID蛋白相互作用，允許它們插入線粒體外膜。線粒體膜不穩(wěn)定，允許形成線粒體凋亡誘導(dǎo)的通道，其促進(jìn)細(xì)胞色素c釋放到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素c是促凋亡因子，其與蛋白質(zhì)凋亡蛋白酶激活因子-1（APAF-1）相互作用，其募集胱天蛋白酶原-9以形成凋亡體復(fù)合物。該復(fù)合物的形成裂解并激活凋亡引發(fā)劑caspase-9以啟動(dòng)半胱天冬酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，*終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。（對(duì)于外在途徑機(jī)制，請(qǐng)參考上面的圖1）
檢測(cè)線粒體膜電位（MMP）的變化是內(nèi)在激活細(xì)胞凋亡的重要指標(biāo)。百螢生物開發(fā)了專有的陽(yáng)離子線粒體探針，可靈敏地檢測(cè)靶細(xì)胞線粒體膜電位的任何變化。這些專有探針可作為百螢生物的Cell Meter?MMP檢測(cè)試劑盒中的關(guān)鍵組分，用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞活力。在正常細(xì)胞中，這些線粒體探針發(fā)出紅色熒光，其信號(hào)強(qiáng)度與線粒體內(nèi)積累的探針量成比例。能夠在線粒體內(nèi)積聚的探針越多，發(fā)出的熒光信號(hào)越強(qiáng)烈。然而，在凋亡細(xì)胞中，在MMP崩潰后，線粒體染料的熒光強(qiáng)度減弱，表明細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡的caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)。這些試劑盒已經(jīng)過單獨(dú)優(yōu)化，可用于熒光顯微鏡和熒光和流式細(xì)胞儀檢測(cè)中的凋亡激活劑和抑制劑的篩選。該試劑盒可與其他試劑結(jié)合使用，如Cell Meter?磷脂絲胺酸細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，用于細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡的多參數(shù)研究。