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公司新聞

ELISA測定及三種測定方法詳細(xì)介紹


今天百螢為大家介紹一下關(guān)于ELISA的小知識,什么是ELISA?ELISA的檢測方法有哪些?優(yōu)缺點(diǎn)是什么?*好用的ELISA檢測試劑/試劑盒是什么?感興趣的朋友一起來看看吧!

酶聯(lián)**吸附測定法(ELISA)是一種使用酶標(biāo)儀進(jìn)行測定的**測定法,用于檢測和定量生物分子,例如抗體、蛋白質(zhì)、**或肽,以及表征蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-核酸相互作用。在ELISA中,將用于實(shí)驗(yàn)的靶標(biāo)(通常是抗原)固定在固體表面上,然后用辣根過氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(AP)的酶綴合抗體進(jìn)行檢測。通過與被酶催化的底物孵育來實(shí)現(xiàn)定量,從而產(chǎn)生可測量的副產(chǎn)物。


酶聯(lián)**吸附測定(ELISA)概述

ELISA測定法通常在96孔板中進(jìn)行。這些板被設(shè)計(jì)成通常通過直接吸附到微量滴定板的表面上或間接地通過預(yù)先包被的抗體間接地結(jié)合和固定抗原。固定后,將一抗引入樣品中,與抗原形成**復(fù)合物。一抗可以共價標(biāo)記到酶(例如HRP)上,或者如果一抗被生物素標(biāo)記,則一抗本身可以使用酶標(biāo)記的二級抗體或鏈霉親和素偶聯(lián)物間接檢測。通過與合適的底物孵育來評估共軛酶的活性,從而實(shí)現(xiàn)檢測,該底物會產(chǎn)生可測量的副產(chǎn)物。試劑盒在靈敏度和成像設(shè)備的兼容性方面各不相同。

直接與間接檢測

在ELISA中檢測**抗體-抗原復(fù)合物的方法可以是直接的或間接的(圖1)。在直接檢測方法中,與報告酶(例如HRP或AP)綴合的單一一抗可以直接檢測靶抗原。通過間接檢測,可以依次使用雙抗體系統(tǒng)檢測目標(biāo)靶標(biāo)。首先,將樣品與針對目標(biāo)抗原的未標(biāo)記一抗孵育。然后,使用一抗特異的酶標(biāo)二抗檢測其存在,從而檢測靶抗原。如果使用生物素化的一抗檢測抗原,則使用酶標(biāo)記的抗生蛋白鏈菌素偶聯(lián)物作為您的**檢測試劑。

使用哪種檢測方法取決于靶抗原的表達(dá)水平。為了檢測高度表達(dá)的抗原,直接檢測是合適的方法。當(dāng)靈敏度至關(guān)重要時,例如檢測低豐度靶標(biāo)或表達(dá)**的抗原,請使用間接檢測方法來增強(qiáng)信號。

圖1.使用靶標(biāo)特異性抗體進(jìn)行直接和間接抗原檢測的圖示。


ELISA的三種檢測方法

1.直接法

在直接ELISA中,抗原通過被動吸附直接固定在板的表面,并使用HRP標(biāo)記的一抗進(jìn)行檢測。將無色底物引入樣品,該底物與酶結(jié)合物反應(yīng),并產(chǎn)生可測量的副產(chǎn)物。根據(jù)底物的選擇,該副產(chǎn)物可以是比色的,化學(xué)發(fā)光的或熒光的。信號產(chǎn)生的大小與樣品中抗原的數(shù)量成正比。在所有ELISA法中,直接ELISA分析*簡單,執(zhí)行*快,但靈敏度*低。

方案:比色直接ELISA

  1. 用檢測抗原包被ELISA板,密封板并在4°C下孵育過夜
  2. 去除染料溶液并用所需的緩沖液洗板2次
  3. 在4°C下用所需的封閉溶液封閉板1小時
  4. 用緩沖液洗板3次
  5. 與HRP標(biāo)記的一抗在室溫下孵育1小時
  6. 用緩沖液洗板4次
  7. 在室溫下用ReadiUse TMB底物溶液(#11012)接種板15-30分鐘。
  8. 使用Signal Guard HRP反應(yīng)停止溶液(#11020)停止反應(yīng)
  9. 用ELISA酶標(biāo)儀測量650 nm處的吸光度信號

圖2:直接ELISA圖解。

直接ELISA檢測
優(yōu)點(diǎn)
  • 簡單快捷,需要更少的試劑和更少的步驟
  • 消除了二抗的交叉反應(yīng)
缺點(diǎn)
  • 抗原固定不明確會導(dǎo)致潛在的高背景干擾
  • 一抗必須單獨(dú)標(biāo)記,這既費(fèi)時又昂貴
  • 酶對一抗偶聯(lián)物的**反應(yīng)性可能會產(chǎn)生不利影響
  • 柔韌性低,因?yàn)楸仨毰悸?lián)一抗
  • 無信號放大

2.間接法

間接ELISA本質(zhì)上是直接ELISA的修改版本。在間接ELISA中,用于檢測抗原的一抗是未偶聯(lián)的。取而代之的是,對一抗的宿主物種具有反應(yīng)性的酶標(biāo)二級抗體被用于檢測一抗-抗原復(fù)合物(間接檢測抗原)。將無色底物引入樣品,該底物與酶結(jié)合物反應(yīng),并產(chǎn)生可測量的副產(chǎn)物。根據(jù)底物的選擇,該副產(chǎn)物可以是比色的,化學(xué)發(fā)光的或熒光的。信號產(chǎn)生的大小與樣品中抗原的數(shù)量成正比。與直接ELISA相比,使用輔助檢測試劑具有明顯的優(yōu)勢,即信號放大。

方案:比色間接ELISA

  1. 用檢測抗原包被ELISA板,密封板并在4°C下孵育過夜
  2. 去除染料溶液并用所需的緩沖液洗板2次
  3. 在4°C下用所需的封閉溶液封閉板1小時
  4. 用緩沖液洗板2次
  5. 與未偶聯(lián)的一抗在室溫下孵育1小時
  6. 用緩沖液洗板4次
  7. 在室溫下與HRP標(biāo)記的二抗(在封閉緩沖液中)孵育1小時
  8. 用緩沖液洗板4次
  9. 在室溫下用ReadiUse TMB底物溶液(#11012)接種板15-30分鐘。
  10. 使用Signal Guard HRP反應(yīng)停止溶液(#11020)停止反應(yīng)
  11. 用ELISA酶標(biāo)儀測量650 nm處的吸光度信號

圖3:間接ELISA圖解。

間接ELISA檢測
優(yōu)點(diǎn)
  • 方便-多種預(yù)標(biāo)記的二抗可商購
  • 經(jīng)濟(jì)–需要更少的標(biāo)記抗體
  • 高度敏感–一抗包含多種表位,可結(jié)合幾種標(biāo)記的二抗,導(dǎo)致信號放大
  • 非常靈活–單個二抗可用于檢測不同的一抗
  • 保留一抗的*大**反應(yīng)性
  • 相同的一抗(例如生物素/鏈霉親和素)可以使用不同的可視化標(biāo)記
缺點(diǎn)
  • 來自二抗的潛在交叉反應(yīng),導(dǎo)致非特異性染色
  • 與直接ELISA相比更長的操作流程需要額外的孵育步驟

3.夾心法

夾心ELISA分析是*常用的ELISA形式。它需要使用匹配的抗體對,從而每種抗體對抗原上不同的非重疊表位具有特異性。首先將一種抗體,稱為捕獲抗體,包被在多孔微量滴定板的表面上,以促進(jìn)靶抗原的固定。然后,**種抗體(稱為檢測抗體)與捕獲抗體-抗原復(fù)合物結(jié)合。*后,添加對檢測抗體(而非捕獲抗體)具有特異性的酶標(biāo)記的**抗體偶聯(lián)物。

方案:比色夾心ELISA

  1. 用捕獲抗體,密封板包被PCV微量滴定板的孔,并在4°C下孵育過夜
  2. 去除染料溶液并用所需的緩沖液洗板2次
  3. 在4°C下用所需的封閉溶液封閉板1小時
  4. 用所需緩沖液洗板2次
  5. 向每個孔中添加樣品,在37°C下孵育2小時
  6. 取出樣品并用所需緩沖液洗板2次
  7. 與未偶聯(lián)的檢測抗體在室溫下孵育1小時
  8. 用所需緩沖液洗板4次
  9. 在室溫下與HRP標(biāo)記的二抗(在封閉緩沖液中)孵育1小時
  10. 用所需緩沖液洗板4次
  11. 在室溫下用ReadiUse TMB底物溶液(貨號11012)接種板15-30分鐘。
  12. 使用Signal Guard HRP反應(yīng)停止溶液(目錄號11020)停止反應(yīng)
  13. 用ELISA酶標(biāo)儀測量650 nm處的吸光度信號

圖4:夾心ELISA圖解。

夾心ELISA檢測
優(yōu)點(diǎn)
  • 高靈敏度–靈敏度比直接或間接ELISA形式高2至5倍
  • 非常靈活–直接和間接檢測均可使用
  • 高特異性–由于使用了匹配的抗體對,因此可以特異性地捕獲和檢測抗原
  • 適用于復(fù)雜,粗略或不純的樣品–抗原無需在測量前純化
缺點(diǎn)
  • 優(yōu)化匹配抗體對可能很困難–捕獲和檢測抗體可能會發(fā)生交叉反應(yīng)

通用ELISA測定試劑盒

貨號 產(chǎn)品名稱 Ex(nm) Em(nm) 規(guī)格 價格
11540 Amplite 熒光法羊抗鼠IgG-HRP偶聯(lián)物ELISA檢測試劑盒 紅色熒光 571 585 1000 Tests 2460
11541 Amplite 熒光法羊抗兔IgG-HRP偶聯(lián)物ELISA檢測試劑盒 紅色熒光 571 585 1000 Tests 2460
36370 Screen Quest cAMP檢測試劑盒*比色ELISA法* 650
1 plate 3720
36371 Screen Quest cAMP檢測試劑盒*比色ELISA法* 650
10 plate 24576
36373 Screen Quest cAMP檢測試劑盒*熒光ELISA法* 571 585 1 plate 3720
36374 Screen Quest cAMP檢測試劑盒*熒光ELISA法* 571 585 10 plate 24576
36379 Screen Quest 免洗cAMP檢測試劑盒*熒光能量共振轉(zhuǎn)移法* 390 650 1 plate 6240
36380 Screen Quest 免洗cAMP檢測試劑盒*熒光能量共振轉(zhuǎn)移法* 390 650 10 plate 10716
36381 Screen Quest 免洗cAMP檢測試劑盒*熒光能量共振轉(zhuǎn)移法* 390 650 50 plate 44100

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