今天，百螢為大家介紹使用PCR來(lái)對(duì)病毒DNA/RNA進(jìn)行標(biāo)記、定量、檢測(cè)的熒光探針。在臨床分子診斷中，核酸擴(kuò)增檢測(cè)法，例如“逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）”可以用來(lái)早期檢測(cè)和鑒定由逆轉(zhuǎn)錄病毒引起的傳染病。RT-PCR以mRNA為起始模板，可在體外快速轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增和檢測(cè)逆轉(zhuǎn)錄病毒的遺傳物質(zhì)。核酸檢測(cè)已成功用于檢測(cè)大多數(shù)逆轉(zhuǎn)錄病毒，包括流感病毒，腸病毒，冠狀病毒，埃博拉病毒和HIV。
逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）
逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）是檢測(cè)和定量mRNA表達(dá)水平的高度靈敏技術(shù)。在RT-PCR中，使用逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA模板逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA）。然后使用標(biāo)準(zhǔn)PCR程序（變性，退火和延伸）將cDNA用作擴(kuò)增模板。RT-PCR可用于多種應(yīng)用，包括基因表達(dá)分析，微陣列，病原體檢測(cè)和**研究。
表1.RNA定量試劑/試劑盒
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產(chǎn)品名稱(chēng)
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Ex（nm）
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Em（nm）
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規(guī)格
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貨號(hào)
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|
StrandBrite 綠色熒光RNA定量試劑盒*高選擇性*
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490nm
|
540nm
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100 Tests
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17657
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StrandBrite 綠色RNA定量試劑
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490nm
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525nm
|
1ml
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17610
|
|
10ml
|
17611
|
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Portelite 熒光RNA定量試劑盒
|
490nm
|
525nm
|
100 Tests
|
17658
|
|
500 Tests
|
17659
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RT-PCR定量方法及產(chǎn)品
RT-PCR產(chǎn)物的定量方法通?？煞譃閮深?lèi)：終點(diǎn)RT-PCR和實(shí)時(shí)PCR。終點(diǎn)RT-PCR常用來(lái)測(cè)量少量樣品中的基因表達(dá)變化，而實(shí)時(shí)RT-PCR已成為在全球范圍內(nèi)驗(yàn)證基因表達(dá)變化的標(biāo)準(zhǔn)方法。
1.終點(diǎn)RT-PCR
終點(diǎn)RT-PCR是在完成*后一個(gè)PCR循環(huán)后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行的分析。 用于定量終點(diǎn)RT-PCR的通用測(cè)量方法要求通過(guò)使用熒光染料（例如溴化乙錠EB）或P32標(biāo)記的PCR產(chǎn)物的定量來(lái)檢測(cè)基因表達(dá)水平。 終點(diǎn)RT-PCR可用于通過(guò)三種不同方法測(cè)量表達(dá)水平的變化：相對(duì)，競(jìng)爭(zhēng)和比較。
表2.終點(diǎn)RT-PCR檢測(cè)方法
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終點(diǎn)RT-PCR
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特點(diǎn)
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相對(duì)RT-PCR
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-
利用引物進(jìn)行內(nèi)部對(duì)照，并與基因特異性引物多路復(fù)用
-
需要兼容的內(nèi)部對(duì)照和基因特異性引物
-
可以比較多個(gè)樣本之間的相對(duì)轉(zhuǎn)錄本豐度
-
結(jié)果用基因信號(hào)與內(nèi)控信號(hào)的比值表示，可用于樣本間比較，以估計(jì)相對(duì)靶RNA的表達(dá)
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競(jìng)爭(zhēng)性RT-PCR
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-
用于**定量樣品中特定mRNA的技術(shù)。
-
將合成RNA和競(jìng)爭(zhēng)RNA添加到樣品RNA復(fù)制物中，并與內(nèi)源性靶標(biāo)共同擴(kuò)增
-
產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)RNA的濃度曲線(xiàn)，并將其用于比較內(nèi)源轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生的RT-PCR信號(hào)，以確定樣品中存在的靶標(biāo)量
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比較RT-PCR
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-
類(lèi)似于競(jìng)爭(zhēng)性RT-PCR，在一個(gè)單一反應(yīng)中，靶RNA與一個(gè)不相關(guān)序列的內(nèi)標(biāo)競(jìng)爭(zhēng)擴(kuò)增試劑
-
將結(jié)果與外標(biāo)曲線(xiàn)比較，以確定目標(biāo)RNA濃度
-
這三種方法更方便，因?yàn)樗恍枰A(yù)先確定mRNA（相對(duì)RT-PCR）或合成競(jìng)爭(zhēng)性RNA（競(jìng)爭(zhēng)性RT-PCR）
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2.實(shí)時(shí)RT-PCR
實(shí)時(shí)PCR（RT-PCR）使用熒光報(bào)告分子來(lái)可靠地檢測(cè)在PCR過(guò)程的每個(gè)循環(huán)中生成的產(chǎn)物。（隨著反應(yīng)的進(jìn)行，由于每個(gè)擴(kuò)增循環(huán)中PCR產(chǎn)物的積累，熒光增加。）。這些熒光報(bào)告分子包括結(jié)合到雙鏈DNA的染料（例如Cyber Green ）或序列特異性探針（例如Molecular Beacons）。
2.1使用DNA結(jié)合染料的非特異性檢測(cè)
在實(shí)時(shí)PCR中，DNA結(jié)合染料被用作熒光報(bào)告基因，以實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR反應(yīng)。隨著產(chǎn)物在每個(gè)連續(xù)的擴(kuò)增循環(huán)中的積累，報(bào)告染料的熒光增強(qiáng)。記錄每個(gè)循環(huán)的熒光發(fā)射量，可以檢測(cè)指數(shù)期的PCR反應(yīng)。 Cyber Green 是一種敏感的雙鏈DNA特異性染料，針對(duì)實(shí)時(shí)RT-PCR進(jìn)行了優(yōu)化。在溶液中，未與DNA結(jié)合的染料幾乎沒(méi)有熒光。當(dāng)染料與雙鏈DNA結(jié)合時(shí)，熒光會(huì)大大增強(qiáng)。與市面常見(jiàn)的SYBR Green相比，Cyber Green一般較少抑制RT-PCR也不太可能導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。Cyber Green可以在更高的染料濃度高中，產(chǎn)生更強(qiáng)的PCR信號(hào)。較高的Cyber Green濃度允許用于qPCR消除“染料再分配”的問(wèn)題。盡管雙鏈DNA結(jié)合染料為實(shí)時(shí)PCR提供了*方便，*便宜的選擇，但它有一個(gè)很明顯的缺點(diǎn)是特異性和非特異性產(chǎn)物均會(huì)產(chǎn)生信號(hào)。
表3.DNA結(jié)合染料
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產(chǎn)品名稱(chēng)
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Ex（nm）
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Em（nm）
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規(guī)格
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貨號(hào)
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Cyber Green 核酸凝膠染料 [相當(dāng)于SYBR®Green] * 20X水性PCR溶液*
|
498nm
|
522nm
|
5 x 1 mL Tests
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17591
|
|
1ml
|
17592
|
|
Cyber Green 核酸凝膠染料[相當(dāng)于SYBR®Green]
|
498nm
|
522nm
|
100ul
|
17604
|
|
1ml
|
17590
|
|
Cyber Green 核酸凝膠染料
|
498nm
|
522nm
|
1ml
|
TJ1700
|
|
Peko Green雙鏈核酸凝膠染料
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502nm
|
523nm
|
1ml
|
TJ1701
|
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Cyber Gold核酸凝膠染料
|
300nm
|
539nm
|
500ul
|
TJ1702
|
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Cyber Safe DNA 凝膠電泳染料
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280nm
|
530nm
|
500ul
|
TJ1703
|
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JJ Green 核酸凝膠染料
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497nm
|
520nm
|
500ul
|
TJ1704
|
|
Ru Red 核酸凝膠染料
|
300nm
|
605nm
|
500ul
|
TJ1710
|
|
JJ Red 核酸凝膠染料
|
518nm
|
605nm
|
500ul
|
TJ1705
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2.2使用目標(biāo)特異性FRET探針進(jìn)行特異性檢測(cè)
分子信標(biāo)是一個(gè)單鏈寡核苷酸序列，用兩個(gè)熒光團(tuán)標(biāo)記，并保持“發(fā)夾”狀結(jié)構(gòu)。在目標(biāo)序列的存在下，它們會(huì)展開(kāi)、結(jié)合并發(fā)出熒光。分子信標(biāo)由四部分組成：
-
Loop：由與靶序列互補(bǔ)的分子信標(biāo)的18-30個(gè)堿基對(duì)區(qū)域組成。
-
Stem：在環(huán)的兩個(gè)末端連接的是兩個(gè)相互互補(bǔ)的（5至7個(gè)核苷酸殘基）短寡核苷酸。
-
5'末端熒光團(tuán)：在分子信標(biāo)的5'末端共價(jià)連接有熒光染料。
-
3'末端淬滅劑：在分子信標(biāo)的3'末端共價(jià)連接了一個(gè)非熒光猝滅劑。
2.2.1 Tide Fluor 寡核苷酸標(biāo)記系列產(chǎn)品
Tide Fluor 染料經(jīng)過(guò)優(yōu)化，可用于FRET寡核苷酸和肽標(biāo)記。我們的Tide Fluor 染料比香豆素，熒光素，羅丹明和花青等經(jīng)典標(biāo)記染料具有更強(qiáng)的熒光性和更高的光穩(wěn)定性。它們是在不降低性能的情況下標(biāo)記肽和寡核苷酸的*佳熒光染料。
表4.經(jīng)典熒光標(biāo)記染料
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香豆素及其衍生物
|
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熒光素染料及其衍生物
|
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羅丹明染料及其衍生物
|
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花青染料及其衍生物
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吲哚菁綠（ICG）及其衍生物
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表5.Tide Fluor 染料和光譜性質(zhì)
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Tide Fluor染料
|
Abs（nm）
|
Em（nm）
|
ε 1
|
Φ 2
|
260 nm處CF3
|
280 nm處的CF 4
|
|
Tide Fluor 1
|
345
|
442
|
20000
|
0.95
|
0.246
|
0.187
|
|
Tide Fluor 2WS
|
502
|
525
|
75000
|
0.9
|
0.211
|
0.091
|
|
Tide Fluor 2
|
500
|
527
|
75000
|
0.9
|
0.288
|
0.201
|
|
Tide Fluor 3WS
|
555
|
565
|
150000
|
0.105
|
0.079
|
0.079
|
|
Tide Fluor 3
|
555
|
584
|
85000
|
0.85
|
0.331
|
0.201
|
|
Tide Fluor 4
|
590
|
618
|
90000
|
0.91
|
0.489
|
0.436
|
|
Tide Fluor 5WS
|
649
|
664
|
250000
|
0.25
|
0.023
|
0.027
|
|
Tide Fluor 6WS
|
676
|
695
|
220000
|
0.18
|
0.111
|
0.009
|
|
Tide Fluor 7WS
|
749
|
775
|
275000
|
0.12
|
0.009
|
0.049
|
|
Tide Fluor 8WS
|
775
|
807
|
250000
|
0.08
|
0.103
|
0.109
|
-
ε= *大吸收波長(zhǎng)處的消光系數(shù)（cm -1 M -1）
-
Φ=水性緩沖液（pH 7.2）中的熒光量子產(chǎn)率
-
260 nm處的CF是校正因子，用于消除染料對(duì)260 nm處的吸光度的影響（用于寡核苷酸和核酸標(biāo)記）
-
280 nm處的CF是校正因子，用于消除染料對(duì)280 nm處的吸光度的影響（用于肽和蛋白質(zhì)標(biāo)記）
2.2.2 Tide Quencher 淬滅劑系列產(chǎn)品
DABCYL是用于開(kāi)發(fā)各種FRET應(yīng)用的染料，但對(duì)于較長(zhǎng)波長(zhǎng)的染料（例如熒光素，羅丹明和花青）的低淬滅效率限制了其在敏感的熒光FRET探針開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用，另外，DABCYL的吸收光譜對(duì)環(huán)境比較敏感。AAT Bioquest已開(kāi)發(fā)出耐用的Tide Quencher 系列產(chǎn)品，用于開(kāi)發(fā)更長(zhǎng)波長(zhǎng)的FRET探針。Tide Quencher 染料是消除經(jīng)典淬滅劑限制的**選擇。
Tide Quencher 染料的主要優(yōu)點(diǎn)：
-
探索其他淬滅劑無(wú)法實(shí)現(xiàn)的FRET應(yīng)用。
-
多種反應(yīng)形式便于自我構(gòu)建所需的FRET生物分子。
-
與所需的熒光供體完全匹配。
-
更低的價(jià)格和更好的性能。
表6.Tide Quencher 染料和光譜性質(zhì)
|
Tide Quencher 系列染料
|
Abs（nm）
|
ε
|
260 nm時(shí)的CF
|
280 nm時(shí)的CF
|
|
Tide Quencher 1
|
488
|
20,000
|
0.147
|
0.194
|
|
Tide Quencher 2
|
512
|
21,000
|
0.100
|
0.120
|
|
Tide Quencher 2WS
|
515
|
21,000
|
0.100
|
0.120
|
|
Tide Quencher 3
|
576
|
22,000
|
0.085
|
0.091
|
|
Tide Quencher 3WS
|
576
|
90,000
|
0.186
|
0.205
|
|
Tide Quencher 4
|
604
|
23,000
|
0.146
|
0.183
|
|
Tide Quencher 4WS
|
604
|
90,000
|
0.149
|
0.136
|
|
Tide Quencher 5
|
661
|
24,000
|
0.170
|
0.082
|
|
Tide Quencher 5WS
|
661
|
130,000
|
0.072
|
0.082
|
|
Tide Quencher 6WS
|
691
|
130,000
|
0.120
|
0.102
|
|
Tide Quencher 7WS
|
759
|
140,000
|
0.072
|
0.091
|
2.2.3 Covidyte 肽底物系列產(chǎn)品
Covidyte系列產(chǎn)品是AAT Bioquest針對(duì)COVID-19*新研發(fā)的肽底物，用于通過(guò)FRET檢測(cè)冠狀病毒蛋白酶的強(qiáng)度。該系列產(chǎn)品為尋找冠狀病毒蛋白酶抑制劑提供了高靈敏的熒光信號(hào)強(qiáng)度。
表7.Covidyte 肽底物
|
產(chǎn)品名稱(chēng)
|
貨號(hào)
|
規(guī)格
|
Ex(nm)
|
Em(nm)
|
|
Covidyte ED450
|
13537
|
100 Tests
|
334
|
453
|
|
Covidyte EN450
|
13535
|
100 Tests
|
334
|
453
|
|
Covidyte TF670
|
13541
|
100 Tests
|
648
|
663
|
|
Covidyte IF670
|
13542
|
100 Tests
|
654
|
669
|
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