簡介
Calcein AM是一種疏水性化合物，可以很容易地滲透到完整的活細(xì)胞中。 它廣泛用于細(xì)胞活力測定。 通過細(xì)胞內(nèi)酯酶水解非熒光鈣黃綠素AM產(chǎn)生強熒光的親水鈣黃綠素，其在細(xì)胞質(zhì)中良好保留。 酯酶活性與活細(xì)胞數(shù)成正比，因此與熒光強度直接相關(guān)鈣黃綠素產(chǎn)生自酯酶催化的鈣黃綠素AM水解。 Calcein AM是用于標(biāo)記和監(jiān)測活細(xì)胞細(xì)胞功能的流行的熒光探針之一。 然而，Calcein AM的單色使得在多色應(yīng)用中不可能使用這種有價值的試劑。 例如，由于鈣黃綠素AM具有與GFP相同的顏色，因此不可能將鈣黃綠素AM與GFP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞組合使用。
光譜特性
為了解決上述Calcein AM的顏色限制，我們開發(fā)了Calcein Orange?和Calcein Red?。 這兩種新的Calcein AM類似物與Calcein AM結(jié)合使用，可以對活細(xì)胞進(jìn)行多色標(biāo)記和功能分析。 此外，我們還開發(fā)了CytoCalcein?Violet 450，CytoCalcein?Violet 500，CytoCalcein?Blue 550和CytoCalcein?Blue 600，用于流式細(xì)胞儀應(yīng)用。 CytoCalcein?染料與Calcein具有相似的生物學(xué)特性，它們針對各種流式細(xì)胞儀的激發(fā)波長進(jìn)行了優(yōu)化，為活細(xì)胞的流式細(xì)胞分析提供了額外的顏色。 CytoCalcein?Violet 450和CytoCalcein?Violet 500被紫激光（405 nm）激發(fā)，并分別在450 nm和500 nm發(fā)出熒光。 CytoCalcein?Blue 550和CytoCalcein?Blue 550被藍(lán)色激光（488 nm）激發(fā)，并分別在550 nm和600 nm處發(fā)出熒光。
表1.細(xì)胞活力檢測試劑的光譜特性
使用細(xì)胞活力指標(biāo)AM酯類
AM酯是非極性酯，其易于穿過活細(xì)胞膜，并且通過活細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞酯酶快速水解。 AM酯廣泛用于非侵入性地將各種極性熒光探針加載到活細(xì)胞中。 但是，使用AM酯時必須小心，因為它們易于水解，特別是在溶液中。 它們應(yīng)在使用前重新配制上等無水二甲基亞砜（DMSO）。 DMSO儲備溶液可以在-20℃下干燥儲存并避光。 在這些條件下，AM酯應(yīng)穩(wěn)定數(shù)月。
以下是我們推薦的將AM酯加載到活細(xì)胞中的方案。 該步驟僅提供指南，應(yīng)根據(jù)您的特定需求進(jìn)行修改。
a）在高質(zhì)量無水DMSO中制備2至5mM AM酯的儲備溶液。非離子的洗滌劑Pluronic®F-127有時用于增加AM酯的水溶性。
注意：可將等體積的20％Pluronic®F-127溶液添加到DMSO儲備溶液中細(xì)胞活力指示劑在稀釋到上樣緩沖液之前。Pluronic®F-127
濃度約為0.02％。各種Pluronic®F-127解決方案可從AAT獲取
注意：不建議在Pluronic®F-127存在下長期儲存AM酯。
b）在實驗當(dāng)天，要么在DMSO中溶解細(xì)胞活力的固體指標(biāo)，要么溶解細(xì)胞活力將等份的指示劑儲備溶液解凍至室溫。準(zhǔn)備一個有效的解決方案在您選擇的緩沖液中1至10μM（如Hanks和Hepes緩沖液）。對于大多數(shù)細(xì)胞建議濃度范圍為4至5μM的細(xì)胞活力指標(biāo)。細(xì)胞加載所需指標(biāo)的確切濃度必須根據(jù)經(jīng)驗確定。
c）如果您的細(xì)胞含有有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白，丙磺舒（1-2.5 mM）或磺吡酮可以向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入（0.1-0.25mM）以減少脫酯化指示劑的泄漏。在室溫或37℃下將細(xì)胞與AM酯孵育20分鐘至1小時。
注意：降低加載溫度可能會降低指示器的劃分。
d）在細(xì)胞活力指示劑緩沖液（含有陰離子轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑，如果適用）中洗滌細(xì)胞以除去過量的探針。
注意：通過流式細(xì)胞術(shù)立即分析細(xì)胞樣品，以確定零時間的每個細(xì)胞的平均熒光而不洗滌。
e）在所需的Ex / Em波長下進(jìn)行實驗（見表1）。
儲存條件：
儲存于-20°C，避光。 到期日為自收到之日起6個月。
參考文獻(xiàn)
1. Zibek S, Stett A, Koltay P, Hu M, Zengerle R, Nisch W, Stelzle M. (2006) Localized functional chemical stimulation of TE 671 cells cultured on nanoporous membrane by calcein and acetylcholine. Biophys J.
2. Klesius PH, Evans JJ, Shoemaker CA, Pasnik DJ. (2006) A vaccination and challenge model using calcein marked fish. Fish Shellfish Immunol, 20, 20.
3. Bratosin D, Mitrofan L, Palii C, Estaquier J, Montreuil J. (2005) Novel fluorescence assay using calcein-AM for the determination of human erythrocyte viability and aging. Cytometry A, 66, 78.
4. Schoonen WG, Westerink WM, de Roos JA, Debiton E. (2005) Cytotoxic effects of 100 reference compounds on Hep G2 and HeLa cells and of 60 compounds on ECC-1 and CHO cells. I mechanistic assays on ROS, glutathione depletion and calcein uptake. Toxicol In Vitro, 19, 505.
5. Uggeri J, Gatti R, Belletti S, Scandroglio R, Corradini R, Rotoli BM, Orlandini G. (2004) CalceinAM is a detector of intracellular oxidative activity. Histochem Cell Biol, 122, 499.
6. Mueller H, Kassack MU, Wiese M. (2004) Comparison of the usefulness of the MTT, ATP, and calcein assays to predict the potency of cytotoxic agents in various human cancer cell lines. J Biomol Screen, 9, 506.
7. Iwanowicz LR, Densmore CL, Ottinger CA. (2004) Calcein AM release-based cytotoxic cell assay for fish leucocytes. Fish Shellfish Immunol, 16, 127. 8. Tokudome Y, Sugibayashi K. (2003) The synergic effects of various electrolytes and electroporation on the in vitro skin permeation of calcein. J Control Release, 92, 93.