如何避免鈣離子檢測時(shí)遇到的避免高背景？信號強(qiáng)度低？AAT Bioquest 曾推出過一系列產(chǎn)品：Calbryte?，它是用于檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的，比Fluo-4等傳統(tǒng)熒光探針有更好的實(shí)驗(yàn)效果。
Calbryte?包括三種新的鈣離子指示劑：Calbryte?520，Calbryte?590和Calbryte?630。Calbryte?系列已針對熒光顯微鏡，熒光酶標(biāo)儀和流式細(xì)胞儀進(jìn)行了優(yōu)化，它們還可用于高通量篩選應(yīng)用。 與傳統(tǒng)的Fluo-3、Fluo-4比較，Calbryte?探針具有幾個(gè)關(guān)鍵優(yōu)勢 ：Calbryte?探針可產(chǎn)生更明亮的信號，顯著改善的信號與背景比，并大大增強(qiáng)細(xì)胞保留。這些特性使Calbryte?系列成為比傳統(tǒng)的鈣指示劑更好的選擇。
圖1 Fluo-4，AM（左）和Calbryte TM 520 AM（右）在CHO-K1細(xì)胞中測量ATP響應(yīng)。將CHO-K1細(xì)胞以50,000個(gè)細(xì)胞/100μL/孔接種過夜，置于96孔黑色壁/透明底板中。加入含有丙磺舒或10μg/ ml Fluo-4的AMH緩沖液中的100μL10μg/ ml Calbryte TM 520AM，在含有丙磺舒的HH緩沖液中的AM，并在37℃下孵育45分鐘。然后除去染料加載溶液并用200μLHH緩沖液/孔替換。加入ATP（50μL/孔）以達(dá)到10μM的*終指示濃度，然后用顯微鏡FITC通道（Keyence）成像。
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Calbryte?系列探針根據(jù)其*大發(fā)射波長命名 。例如，Calbryte?520在可見光譜的綠**域發(fā)出熒光，而Calbryte?590和Calbryte?630分別在紅色和深紅**域發(fā)出熒光。所有三種指標(biāo)均可以AM酯形式或鹽形式（作為鉀鹽）獲得。AM酯形式是細(xì)胞可滲透的形式，其可用于測定活細(xì)胞中的鈣。鹽形式主要用于鈣指示劑的校準(zhǔn)。當(dāng)根據(jù)熒光信號強(qiáng)度計(jì)算細(xì)胞內(nèi)鈣濃度時(shí)，通常需要該步驟。Calbryte TM的鹽形式也可用于顯微注射到活細(xì)胞和組織中。
Calbryte?染料如何在活細(xì)胞中發(fā)揮作用？
當(dāng)測定活細(xì)胞中的鈣時(shí)，優(yōu)選的方法是用幾種乙酰氧基甲酯（AM酯）官能團(tuán)合成Calbryte TM染料。這樣做的原因是：
1.AM酯是親脂性基團(tuán)，當(dāng)連接到Calbryte TM核心結(jié)構(gòu)時(shí)，產(chǎn)生總體上更疏水的化合物。這種增加的疏水性使Calbryte?AM酯易于滲透完整的脂質(zhì)膜并滲透到活細(xì)胞中。這消除了對電穿孔，顯微注射或其他類似破壞性加載技術(shù)的需要。
2. Calbryte TM染料雖然是AM酯形式，但基本上是非熒光的且不可激活的。只有當(dāng)Calbryte?探針滲透到細(xì)胞中時(shí)，只有在細(xì)胞內(nèi)酯酶切割A(yù)M酯功能基團(tuán)后，Calbryte?染料才會被激活并對鈣有反應(yīng)。這種兩步激活過程很重要，因?yàn)樗鼧O大地減少了非特異性的背景熒光。并且通過擴(kuò)展，它顯著增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)鈣信號。
一旦Calbryte?探針被激活，它就會通過典型的螯合作用來檢測鈣處理。然而，與其他螯合劑如Fluo-3和Fluo-4不同，Calbryte?染料在與鈣結(jié)合時(shí)顯示出更大的響應(yīng)。在實(shí)驗(yàn)中，Calbryte?探針顯示螯合時(shí)熒光增加超過300倍。相比之下，F(xiàn)luo-4僅增加了100倍。熒光響應(yīng)的這種顯著改善允許對傳統(tǒng)鈣指示劑無法檢測的鈣進(jìn)行極其穩(wěn)定的檢測。
使用Calbryte?染料有什么好處？
Calbryte?探針勝過更傳統(tǒng)的鈣質(zhì)指標(biāo)。在活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，Calbryte?染料產(chǎn)生的信號與背景比率比其他染料如Fluo-4高出一個(gè)數(shù)量級。這是實(shí)驗(yàn)研究的一大優(yōu)勢。正如許多研究人員所證明的那樣，信號與背景比率差是數(shù)據(jù)分析的頭疼問題。它將結(jié)果與噪聲混合在一起，掩蓋了潛在的重要數(shù)據(jù)，并導(dǎo)致大量的分析 - 分析變異性。出于這個(gè)原因，在選擇試劑時(shí)，大多數(shù)研究人員更喜歡具有良好信噪比的信號。
信號與背景比率差可能是由多種因素引起的，這些因素主要分為兩類。首先，有些因素會導(dǎo)致信號強(qiáng)度不佳。這些可包括：
1. 低消光系數(shù)或量子產(chǎn)率
2. 目標(biāo)結(jié)合不佳
3. 遠(yuǎn)離激發(fā)源的吸光度*大值（λmax）
Calbryte?探針的研發(fā)就是為了解決這些問題。例如，Calbryte?520的量子產(chǎn)率是Fluo-3或Fluo-4的三倍。這意味著每吸收光的光子，Calbryte?520從根本上發(fā)出比Fluo-3或Fluo-4更多的熒光，從而產(chǎn)生更亮的信號強(qiáng)度。此外，Calbryte?系列中的所有染料都經(jīng)過精心設(shè)計(jì)，使其*大吸光度出現(xiàn)在標(biāo)準(zhǔn)激發(fā)源附近。例如，Calbryte?520（λmax = 492 nm）被 常見的488 nm氬離子激光線激發(fā)。
許多探針表現(xiàn)出差的信號與背景比的**個(gè)原因是由于高背景。高背景可能是由于：
1. 細(xì)胞不透性
2. 高自發(fā)熒光
3. 非特異性激活/結(jié)合
4. 細(xì)胞保留不佳
這些因素中的許多是相關(guān)的，因?yàn)樗鼈兩婕疤结樳M(jìn)入細(xì)胞并在細(xì)胞質(zhì)中有效定位的能力。觀察許多過去的鈣指標(biāo)，它們經(jīng)常遇到兩個(gè)問題之一。1）探針可以是相當(dāng)水溶性的，但是太親水而不能滲透活細(xì)胞。2）它們具有足夠的疏水性以滲透活細(xì)胞，但是具有如此差的水溶性以至于它們在加載過程中會從溶液中沉淀出來。這兩種情況都不可取。使用Calbryte?系列時(shí)，面臨的挑戰(zhàn)是創(chuàng)造一種在水溶性和細(xì)胞滲透性之間達(dá)到微妙平衡的探針。Calbryte?系列通過操縱水溶性官能團(tuán)和上述AM酯基解決了這個(gè)問題。
鈣指示物在活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)不佳的另一個(gè)原因是細(xì)胞保留不佳。這里的問題在于一個(gè)叫做p-糖蛋白1的蛋白質(zhì)家族 （P-gp）的。在許多細(xì)胞中（例如研究良好的HeLa細(xì)胞系），P-gp充當(dāng)ATP依賴性外排泵，主動將大范圍的小分子從細(xì)胞內(nèi)移動到細(xì)胞外空間。關(guān)于鈣指示劑，這引起問題，因?yàn)榛罨拟}指示劑可以通過這些泵“泄漏”出細(xì)胞并進(jìn)入細(xì)胞外基質(zhì)。這種類型的泄漏導(dǎo)致雙重問題。首先，因?yàn)樾孤┑拟}探針已被激活（由于通過細(xì)胞內(nèi)酯酶去除AM酯），它們將與細(xì)胞外基質(zhì)中的游離鈣結(jié)合并發(fā)熒光。然而，該熒光不是感興趣的信號，因此有助于已知的高背景或噪聲。**，探針泄漏到細(xì)胞外空間導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)探針的減少。這導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣的檢測減少和信號強(qiáng)度降低，進(jìn)一步加劇了該問題。
一個(gè)已被熟練使用的解決方案是將丙磺舒與鈣指示劑一起使用。Probenecid是一種通道阻滯劑，在減少探針泄漏方面取得了一定的成功。但是，它的使用遠(yuǎn)非理想的解決方案。這是因?yàn)橛性S多實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)對丙磺舒非常敏感。例如，已顯示感覺神經(jīng)節(jié)的TRPV2受體被丙磺舒激活。另一方面，丙磺舒似乎對TAS2R受體或味覺受體具有抑制作用。對于許多其他血清敏感或**敏感的靶標(biāo)，丙磺舒的作用可能在很大程度上是未知的。這意味著通過使用丙磺舒，研究有可能將完全未知的因素引入實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中。
Calbryte?注意到現(xiàn)有鈣指示劑存在的這一嚴(yán)重問題，專為高性能而設(shè)計(jì)，無需丙磺舒。Calbryte?染料通過仔細(xì)平衡化合物上的離子電荷來實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)。這導(dǎo)致帶負(fù)電荷的親水性分子，一旦進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，就顯示出顯著減少的細(xì)胞滲漏。在無丙磺舒條件下，Calbryte?染料在信號背景比方面優(yōu)于Fluo-4一個(gè)數(shù)量級。
Calbryte?染料的*后一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它們非常適合高通量篩選（HTS）和**發(fā)現(xiàn)應(yīng)用。由于Calbryte?染料具有如此出色的信號與背景比，因此可以無洗滌形式使用（見Cat#36317）。此外，由于不需要添加丙磺舒，Calbryte?染料可以很容易地用于自動化設(shè)置。
用Calbryte TM 520 AM和Fluo-4 AM在CHO-M1細(xì)胞中測量卡巴膽堿劑量反應(yīng)。將CHO-M1細(xì)胞以50,000個(gè)細(xì)胞/100μL/孔接種過夜，置于96孔黑色壁/透明底板中。加入在HH緩沖液中的100μL10μg/ ml Calbryte TM 520AM或在HH緩沖液中的10μg/ ml Fluo-4，并在37℃下孵育45分鐘。然后除去染料加載溶液并用200μLHH緩沖液/孔替換。通過FlexStation 3添加卡巴膽堿（50μL/孔）以達(dá)到*終指示的濃度。
Calbryte?系列產(chǎn)品應(yīng)用了國外成熟的技術(shù)，成功避免了高背景、信號低等問題，詳情咨詢百螢生物。