DNA 片段化代表晚期細(xì)胞凋亡的特征。我們的 Cell Meter? TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒使用專有的不含二甲胂酸鈉的緩沖系統(tǒng)。該試劑盒基于將我們獨(dú)特的專有熒光染料摻入細(xì)胞凋亡過(guò)程中形成的 DNA 片段中。該測(cè)定法經(jīng)過(guò)優(yōu)化，可在不使用抗體的情況下直接檢測(cè)分離或附著細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。該試劑盒提供了所有基本成分和優(yōu)化的檢測(cè)方案。
實(shí)驗(yàn)方案如下：
簡(jiǎn)要概述
1. 用測(cè)試化合物準(zhǔn)備細(xì)胞。
2. 與TUNEL工作溶液在37°C下孵育30分鐘至1小時(shí)。
3. 洗滌細(xì)胞。
4. 用4％甲醛（可選）固定細(xì)胞。
5. 用帶FITC濾光片的熒光顯微鏡或帶FITC通道的流式細(xì)胞儀。讀取Ex / Em = 490/525 nm（截止= 515 nm）處的熒光強(qiáng)度。
注意：在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)之前， 在室溫下解凍所有組件。
工作溶液配制
將0.5μL的100X Tunnelyte Green（組分A）添加到50μL的反應(yīng)緩沖液（組分B）中，使總體積為50.5μL的TUNEL工作溶液。 避光。 注意：應(yīng)單獨(dú)評(píng)估每個(gè)細(xì)胞系，以確定細(xì)胞密度。
實(shí)驗(yàn)步驟
1.根據(jù)您的特定協(xié)議，將細(xì)胞培養(yǎng)至密度以誘導(dǎo)凋亡。 對(duì)于在96孔板培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的貼壁細(xì)胞，我們建議大約30,000至50,000個(gè)細(xì)胞/孔，對(duì)于非貼壁細(xì)胞，建議大約1至2 x 106細(xì)胞/ mL。 同時(shí)，在每種標(biāo)記條件下，用誘導(dǎo)群體相同的密度培養(yǎng)非誘導(dǎo)陰性對(duì)照細(xì)胞群體。 注意：我們用100 nM-1 μM星形孢菌素處理HeLa細(xì)胞4小時(shí)，以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
2.染色和固色：
2.1取出細(xì)胞培養(yǎng)基。
2.2向每個(gè)樣品中添加50μL TUNEL工作溶液。
2.3在37°C下孵育30-60分鐘。
2.4除去TUNEL工作溶液，并用200 μL /孔的PBS洗滌細(xì)胞1-2次。
2.5向每個(gè)樣品中添加100uL反應(yīng)緩沖液（組分B）。
2.6使用Ex / Em = 550/590-650 nm（Cut off= 570 nm）的熒光酶標(biāo)儀，帶TRITC濾光片的熒光顯微鏡或帶FL3通道的流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。
2.7可選：從步驟5中移出反應(yīng)緩沖液，并向每個(gè)孔中添加100 μL /孔/ 96孔板的4％甲醛固定緩沖液（未提供）。注意：對(duì)于非貼壁細(xì)胞，請(qǐng)?zhí)砑铀枇浚ɡ?X106細(xì)胞/ mL）的4％甲醛固定液。
2.8在室溫下將平板孵育20至30分鐘。
2.9去除固定劑。
2.10用PBS洗滌細(xì)胞2-3次，并用100μL PBS /孔/ 96孔板替換。
2.11使用Ex / Em = 550/590-650nm（Cut off= 570 nm）的熒光酶標(biāo)儀，帶TRITC濾光片的熒光顯微鏡或帶FL3通道的流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。
2.12可選：用1X Hoechst（組分C）在Ex / Em = 350/460 nm處染色細(xì)胞核，以進(jìn)行圖像分析
圖為Cell Meter TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒紅色熒光光譜圖