Day One
1、脫水
(1)、65℃烤箱干烤30min。（具體時(shí)間視切片大小多少可調(diào)整，一般不要超過(guò)1h，否則容易脫片）
(2)、二甲苯Ⅰ中15min，之后二甲苯Ⅱ中15min。
(3)、在無(wú)水乙醇Ⅰ，無(wú)水乙醇Ⅱ，95%酒精，80%酒精，70%酒精中分別浸泡各5min。（2、3這兩步都是跑缸的，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該有專門的缸，直接放里面就行了）
(4)、雙蒸水浸泡5min
2、微波修復(fù)抗原：將切片浸入pH6.0，0.01M枸櫞酸修復(fù)液中（配制方法見(jiàn)步驟末尾），電爐或微波爐加熱至92至98℃，持續(xù)15min（注意不要煮沸）。冷卻后（不能人工降溫，不能在冷卻前將切片從熱水中取出）進(jìn)行下一步。
對(duì)于這一步，首先配制好抗原修復(fù)液（根據(jù)你的抗原在胞質(zhì)還是胞核表達(dá)而不同，胞質(zhì)的選用枸櫞酸修復(fù)液，胞核的選用EDTA修復(fù)，EDTA在此暫不做詳細(xì)說(shuō)明），接著將雙蒸水中浸泡后的切片放入修復(fù)液中，拿至微波爐加熱修復(fù)，在此我僅述我們的修復(fù)過(guò)程以供參考。
修復(fù)液盒子外面另外放一盛水的盒子，防止修復(fù)液沸騰蒸發(fā)，首先高火烤8分鐘（具體時(shí)間視切片多少調(diào)整），發(fā)現(xiàn)修復(fù)液沸騰后立刻停止，如果未沸騰再繼續(xù)延長(zhǎng)烤時(shí)間，結(jié)束后等待1min，接著中火烤1min30s，停1分鐘，再中火烤1min30s，停1分鐘，如此循環(huán)共計(jì)30分鐘，結(jié)束后將整個(gè)裝有抗原修復(fù)液和切片的盒子擺到陰涼處自然晾干，晾干后再進(jìn)行下一步。
3、室溫下PBS洗滌5min×3次。（切片全部浸泡在玻璃缸中加入PBS液放入搖床，5min后取出傾去液體，重新加PBS，如此洗滌3次）
4、3%雙氧水室溫孵育15min，以內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。
5、室溫下PBS洗滌5min×3次。（見(jiàn)第3步說(shuō)明）
6、封閉：滴加正常羊血清封閉液（A試劑），37℃孵育30min（具體時(shí)間長(zhǎng)短視情況而定，時(shí)間太長(zhǎng)可能導(dǎo)致特異性抗體也被封閉，做不出結(jié)果來(lái)）。甩去多余的液體，不沖洗。
7、滴加適當(dāng)稀釋的一抗(抗體用PBS稀釋，具體稀釋濃度見(jiàn)抗體說(shuō)明書，一般剛開(kāi)始做的時(shí)候多試驗(yàn)幾個(gè)濃度，如1:50,1:100,1:150等，以尋找出效果好的抗體稀釋濃度)，4℃過(guò)夜，我們一般是將切片擺到底下盛有水的濕盒中放入4℃冰箱過(guò)夜。（舉例1:100稀釋方法：99μL的PBS中加入1μL的抗體。）
The next day
8、取出昨天過(guò)夜的濕盒，37度復(fù)溫30min，PBST沖洗5min×3次。
9、滴加生物素標(biāo)記山羊抗小鼠/兔IgG（B試劑），37 ℃孵育30 min。
10、PBST沖洗5minX3次。
11、滴加適量的辣根酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液（C試劑），37 ℃孵育30 min。
12、PBST 沖洗，5min×3次。
13、DAB顯色：滴加顯色液，室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，一般在3至10min之間。反應(yīng)至顯微鏡下可見(jiàn)棕褐色顆粒為止，蒸餾水終止反應(yīng)，并用蒸餾水洗滌。顯色前先準(zhǔn)備好雙蒸水，切片從顯微鏡上拿下來(lái)后直接入水中。
14、蘇木素復(fù)染。4min后流水沖洗。（蘇木素復(fù)染時(shí)間一般3min即可，視具體情況而定）
15、分化：1%鹽酸酒精（實(shí)驗(yàn)室有專門的缸，不用自備）中浸泡，之后流水沖洗。（分化時(shí)間一般為1-2s，即將切片迅速浸入鹽酸酒精中后迅速提起）
16、藍(lán)化：氨水中浸泡30s~1min，之后流水沖洗。我們的藍(lán)化直接是將切片浸入水中浸泡10min就可以了。
17、脫水：分別在70%酒精、80%酒精、95%酒精、無(wú)水乙醇Ⅰ，無(wú)水乙醇Ⅱ各3min。（這些實(shí)驗(yàn)室有專門的缸，不用自備）
18、透明：二甲苯Ⅰ，二甲苯Ⅱ中浸泡各10min，晾干。（同上）
19、中性樹脂封片，顯微鏡觀察。（封片可干封也可濕封，濕封即浸泡完二甲苯Ⅱ之后不晾干，切片從二甲苯中撈出后迅速滴加樹脂蓋上蓋玻片）
各種液體配制方法：
抗原修復(fù)液中涉及到的液體：
A液——枸櫞酸（檸檬酸）5.2525g+雙蒸水250ML（易長(zhǎng)毛，長(zhǎng)毛后需重配）
B液——枸櫞酸鈉（檸檬酸鈉）14.705g+雙蒸水500ML
抗原修復(fù)液——A液4.5ML+B液20.5ML+雙蒸水225ML
3%雙氧水——90ML雙蒸水+30%雙氧水10ML
PBS——磷酸氫二鈉14.5g+氯化鈉40g+□□1g+磷酸二氫鉀1g+雙蒸水5L
PBST——PBS 2L+（Tween-20） 1ML
DAB顯色劑（配制時(shí)請(qǐng)關(guān)燈避光）——1ML雙蒸餾水加入DAB顯色試劑盒中的A液一滴后混勻，再加入B液、C液各一滴混勻即刻，避光保存，30min內(nèi)使用。